Микробиологическое исследование и определение чувствительности

Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru

Содержание

Резюме

В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.

В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.

Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре и результатах контролируемых клинических исследований

Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.

Этиотропное назначение антибиотиков основано на выделении возбудителя инфекции из очага инфекции и определении его чувствительности к антибиотикам

Вторая причина, обусловливающая необходимость определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам — это получение эпидемиологических данных о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций. В практике эти данные используют при эмпирическом назначении антибиотиков, а также для формирования больничных формуляров.

Методы определения чувствительности к антибиотикам

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам: диффузионные методы с использованием дисков с антибиотиками с помощью Е-тестов методы разведения разведение в жидкой питательной среде (бульоне) разведение в агаре

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. 1).

Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35 о -37 о С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards — NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

Резистентные микроорганизмы (resistant)

К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)

Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.

В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — это наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий

Известно, что микроорганизмы, невзирая на свой «малый рост», тоже имеют пищевые «пристрастия», температурный оптимум, в общем, среду, которая им идеально подходит, где они чувствуют себя комфортно и хорошо, а поэтому начинают интенсивно размножаться и расти.

Бактериологический посев или, как принято называть короче – бак посев, применяется для получения большого количества микробов одного вида (чистая культура) с целью изучения их физико-химических и биологических свойств, чтобы затем полученные данные использовать для диагностики инфекционных заболеваний.

К сожалению, даже популярные нынче иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы, основным недостатком которых являются ложноположительные или ложноотрицательные результаты, не всегда могут идентифицировать возбудителя. Кроме того, они не способны подобрать антибактериальные препараты направленного действия. Подобную задачу решает бак посев, который часто не спешат назначать, ссылаясь на то, что, например, уреа- микоплазмы медленно культивируется, а стоимость анализа немалая. Однако ведь и здоровье того стоит!

Для питания и дыхания нужны условия

Микробиологи нынче знают, что каждому возбудителю нужна своя «родная» среда с учетом ее рН, окислительно-восстановительных потенциалов, вязкости, влажности и осмотических свойств. Среды могут быть мягкими и твердыми, простыми и сложными, универсальными и не очень, однако во всех случаях они должны обеспечивать питание, дыхание, размножение и рост бактериальной клетки.

пример роста микроорганизмов после бак-посева в питательную среду

Некоторые среды (тиогликолевая, Сабуро) подходят для широкого круга микроорганизмов и называются универсальными. Другие же предназначены только для определенных видов, например, пневмококк и золотистый стафилококк, продуцирующие гемолизины, растут на кровяном агаре, который служит для выделения особо «капризных» и, вместе с тем, опасных штаммов. Таким образом, разновидностей сред множество, где каждая из них выращивает свой круг микроорганизмов.

Цель культивирования микроорганизмов и значимость ее для диагностики

Кроме воды, воздуха, почвы, содержащие в тех или иных концентрациях различные микроорганизмы, в том числе и приносящие болезнь (патогенные), многие отрасли медицинской науки интересуют микробы, живущие на коже и слизистых человеческого организма, которые могут быть представлены:

• Постоянными обитателями, не несущими никакой опасности человеку, то есть, нормальной микрофлорой организма, без которой мы просто жить не можем. Например, исчезновение бактерий, живущих в кишечнике и участвующих в процессе пищеварения, приводит к дисбактериозу, лечить который – дело непростое. Так же происходит и с исчезновением вагинальной микрофлоры. Ее тут же заселяют условно-патогенные микроорганизмы, гарднереллы, например, которые вызывают бактериальный вагиноз (гарднереллез);
• Условно-патогенной флорой, которая приносит вред лишь в больших количествах при определенных условиях (иммунодефицит). Вышеназванная гарднерелла – представитель такого типа микроорганизмов;
• Наличием патогенных микробов, которые в здоровом теле не присутствуют. Они чужды человеческому организму, куда попадают случайно при контакте с другим (больным) человеком и вызывают развитие инфекционного процесса, порой, довольно тяжелого или даже смертельного. Например, встреча с возбудителями сифилиса – еще куда ни шло, на первых порах лечится, а вот (упаси Бог!) выпустит на волю холеру, чуму, черную оспу и др.

К счастью, многие из них побеждены и в настоящее время находятся «за семью печатями» в специальных лабораториях, однако человечество в любой момент должно быть готово к нашествию невидимого врага, способного уничтожить целые народы. Бактериологический посев в подобных случаях играет, пожалуй, главную роль в идентификации микроорганизма, то есть, определении рода, вида, типа и т.д. (токсономическое положение), что очень важно для диагностики инфекционных процессов, в том числе и заболеваний, передающихся половым путем.

Таким образом, методы посева, как и питательные среды, бывают разными, тем не менее, цель у них одна: получить чистую культуру без посторонних примесей в виде микробов других классов, которые обитают повсеместно: в воде, в воздухе, на поверхностях, на человеке и внутри его.

Когда назначается бак посев и как разобраться в ответах?

Название микроорганизма и его количество

Бактериологический анализ пациенты сами себе не назначают, это делает врач, если у него есть подозрения, что проблемы больного, предъявляющего различные жалобы, связаны с проникновением в организм патогенного возбудителя или с усиленным размножением микроорганизмов, постоянно живущих с человеком, но проявляющих патогенные свойства только в определенных условиях. Сдав анализ и через некоторое время получив на руки ответ, человек теряется, а порой и пугается, увидев непонятные слова и обозначения, поэтому, чтобы этого не произошло, хочется дать краткое разъяснение по данному вопросу:

1. Первым пунктом заключения, как правило, стоит название возбудителя на латинском языке, например, Escherichiacoli. Это – кишечная палочка, она является естественным обитателем кишечника и в допустимых количествах никакого вреда не приносит;
2. Следующий пункт – концентрация микроорганизма. Е.coli– обильный рост (1х10^ 6 и более) норма – менее 1x10^ 4 ;
3. Далее – патогенность: флора условно-патогенная.

При исследовании биологического материала на присутствие патогенных микроорганизмов ответ может быть отрицательным или положительным («плохой бак посев»), поскольку организм человека является для них лишь временным пристанищем, а не естественной средой обитания.

Иной раз, в зависимости от того, какой материал подлежит посеву, можно увидеть количество микроорганизмов, выраженное в колониеобразующих единицах на мл (одна живая клетка даст рост целой колонии) – КОЕ/мл. Например, посев мочи для бактериологического исследования при норме дает до 10 3 КОЕ/мл всех выявленных бактериальных клеток, в сомнительных случаях (анализ повторить!) – 10 3 – 10 4 КОЕ/мл, при воспалительном процессе инфекционного происхождения – 10 5 и выше КОЕ/мл. О двух последних вариантах в разговорной речи, порой, выражаются просто: «Плохой бак посев».

Как «найти управу» на патогенный микроорганизм?

Одновременно с посевом материала в таких ситуациях производится посев микрофлоры на чувствительность к антибиотикам, который даст четкий ответ врачу – какие антибактериальные препараты и в каких дозах «испугают» «незваного гостя». Здесь тоже есть своя расшифровка, например:

• Вид микроорганизма, допустим, та же Е.coli в количестве 1х10^ 6 ;
• Название антибиотика с обозначением (S) указывает на чувствительность возбудителя к этому препарату;
• Вид антибиотиков, не действующих на микроорганизм, обозначается символом (R).

Бактериологический анализ представляет особую ценность в определении чувствительности к антибиотикам, поскольку основной проблемой в борьбе с хламидией, микоплазмой, уреаплазмой и др. остается подбор действенного лечения, не приносящего вред организму и не ударяющего по карману пациента.

Таблица: альтернативный пример результатов бак-посева с выявлением эффективных антибиотиков

Правильная подготовка к бактериологическому анализу – залог достоверного результата

Бактериологическому анализу может подвергаться любой биологический материал, взятый у человека (кожа, кровь, сперма, слизистые ротовой полости, дыхательных и мочеполовых путей, желудочно-кишечного тракта, органов зрения, слуха и обоняния и др.). Чаще всего бак посев назначают гинекологи и урологи, поэтому на нем следует несколько остановиться.

Правильная подготовка к бактериологическому посеву будет залогом правильного результата, потому что в противном случае, анализ придется сдавать заново и ждать назначенное время. Как сдать кровь на стерильность из вены – это задача медработников. От больного здесь, как правило, ничего не зависит, он просто предоставляет локтевой сгиб, а медсестра производит забор в стерильную пробирку с соблюдением всех правил асептики и антисептики.

Другое дело – моча или мазок из половых путей. Здесь пациент должен обеспечить первый этап (забор), соблюдая предписанные правила. Следует заметить, что моча женщин и мужчин несколько отличается, хотя в мочевом пузыре у обоих полов она стерильна:

• У женщин при прохождении через мочеиспускательный канал может захватить небольшое количество непатогенных кокков, хотя в целом, часто остается стерильной;
• У мужчин все несколько по-другому. Передняя часть уретры может снабдить проходящую мочу находящимися там:
• дифтероидами;
• стафилококками;
• некоторыми непатогенными грамотрицательными бактериями, что и покажет впоследствии бактериологический анализ.

Однако, если они находятся в допустимой концентрации (до 10 3 КОЕ/мл), то пугаться нечего, это вариант нормы.

Чтобы избежать присутствия других микроорганизмов и максимально обеспечить стерильность взятого материала, перед сдачей анализа производится тщательный туалет половых органов (вход во влагалище у женщин закрывается ватным тампоном – защита от попадания отделяемого половых органов). Для анализа берется средняя порция мочи (начало мочеиспускания в унитаз, приблизительно 10 мл средней порции в стерильную баночку, окончание в унитаз). Пациентам необходимо знать: моча, взятая на посев, должна быть обработана не позднее, чем через два часа при хранении не выше 20°С, поэтому следует рассчитывать время на транспортировку.

Кроме этого материал на бак посев при необходимости берут из уретры и прямой кишки у мужчин, из уретры, прямой кишки, влагалища, шейки матки и цервикального канала – у женщин, но это происходит в медицинском учреждении, куда пациент должен прибыть. Подмывание, спринцевание и использование антисептических средств в таких случаях запрещено.

Другие вопросы, волнующие пациентов

Многие пациенты интересуются, сколько дней делается анализ. Однозначно на этот вопрос ответить нельзя, все зависит от того, какой материал подвергается исследованию и какой возбудитель нужно искать. Иногда ответ готов через 3 дня, иногда через неделю или даже дней 10 – 14, поскольку некоторые образцы требуют пересева на другую среду.

Не обходят стороной люди, направляющиеся на бак посев и вопрос о цене анализа. Примерная стоимость в Москве составляет порядка 800 – 1500 рублей. Разумеется, она может быть выше и зависит от широты спектра бактериологического поиска. Бесплатно анализ, наверное, можно сдать при беременности в женской консультации, или в поликлинике по особым медицинским показаниям.

Для беременных бак посев является обязательным, сдается 2 раза (при постановке на учет и в 36 недель), при этом, мазок берется не только из половых путей, но и со слизистых носа и зева. Объектом поиска в данном случае, кроме урогенитальных инфекций, будет золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), который в послеродовом периоде может натворить много бед (гнойный мастит и др). Кроме этого, беременным в обязательном порядке делается посев мочи, соскоба влагалищного эпителия и мазки из шейки матки и цервикального канала.

Многие женщины, перед тем как отправиться на процедуру очень боятся таких страшных слов и начинают раздумывать: «А нужно ли это? Может, не пойти». Спешим заверить, что анализы абсолютно безболезненны. Мазок из шейки матки и цервикального канала берется стерильной цитощеткой, не причиняя женщине абсолютно никакой боли, зато впоследствии бак посев из ш/м и ц/к защитит и будущую мать, и плод от возможных осложнений. Объектом поиска при беременности являются возбудители хламидиоза, уреа- и микоплазмы, дрожжеподобный грибок рода Candida (обычно это Candida albicans), трихомонады и другие условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Видео: ролик-демонстрация по бак-посеву из цервикального канала

Частные случаи, особо интересные сдающим анализы

Попав в половые пути патогенные микроорганизмы, через самое короткое время осваиваются и начинают свою вредную деятельность. Например, всегда патогенные гонококки (Neisseria), являющиеся виновниками довольно неприятной болезни, называемой гонореей и относящейся к ЗППП, чувствуют себя «как дома» буквально на 3 день. Они начинают активно размножаться и смело двигаться по половым путям вверх, захватывая все новые территории. Всем известно, что гонорея нынче неплохо лечится и ее уже почти никто не боится. Но для начала ее нужно найти. Основным методом поиска этой инфекции считается бак посев, культивирование, идентификация с помощью окрашивания по Граму, микроскопия.

Найденные в мазке, взятом «на флору» из половых путей, попарно лежащие «кофейные зерна» (диплококки), не указывают на наличие венерического заболевания. Такая микрофлора влагалища часто появляется в постменопаузе и ни о чем плохом не говорит. Отобранный в нестерильных условиях на предметное стекло и окрашенный метиленовым синим или по Романовскому (цитология) мазок, не может дифференцировать микроорганизм. Он может только предположить и направить пациентку на дополнительное исследование (получение изолированной культуры).

Следует заметить, что, если соскоб со слизистых мочеполовых путей, взятый для посева на уреаплазму, является не таким уж редким явлением, то посева мочи сами врачи часто избегают, поскольку с ней работать сложнее.

Трудности в диагностике создает хламидийная инфекция, приносящая большой вред не только при беременности. Кроме этого, хламидия вызывает множество заболеваний, свойственных не только женщинам, но и мужскому населению тоже, поэтому ее сеют, культивируют, изучают, определяют чувствительность к антибактериальной терапии и, таким образом, борются с ней.

При беременности вообще без бактериологического посева трудно обойтись, поскольку многие микроорганизмы, маскируясь в цитологическом мазке, могут быть пропущены. Между тем, влияние некоторых возбудителей ЗППП на плод бывает губительным. К тому же лечить беременную женщину значительно сложнее, а назначать антибиотики «на глаз» просто недопустимо.

Методы посева

Для выделения чистых культур возбудителей на первом этапе прибегают к их посеву на соответствующие среды, который проводится в специальных (стерильных!) условиях. В основном, перенос материала на среду осуществляется с помощью приспособлений, применяемых еще в 19 века великим Луи Пастером:

• Бактериальной петлей;
• Пастеровской пипеткой;
• Стеклянной палочкой.

Конечно, многие инструменты за 2 столетия претерпели изменения, на смену пришли пластиковые стерильные и одноразовые, однако и старые не остались в прошлом, продолжая и поныне служить микробиологической науке.

Первый этап получения колоний требует соблюдения определенных правил:

1. Посев осуществляется над спиртовкой в боксе, предварительно обработанном дезинфектантами и кварцеванием, или в ламинарном шкафу, обеспечивающем стерильность в рабочей зоне;
2. Одежда медработника, перчатки и среда также должны быть стерильными, поскольку обратное мешает выделению изолированных штаммов;
3. Работать в боксе нужно быстро, но аккуратно, нельзя разговаривать и отвлекаться, при этом – необходимо помнить о личной безопасности, ведь материал может быть заразным.

Выделение штаммов и изучение чистых культур

Выделение штаммов не всегда одинаково, поскольку некоторые биологические среды, находящиеся в человеческом организме требуют индивидуального подхода, например, гемокультуру (кровь) сначала в жидкой среде (соотношение 1 : 10) немного «подращивают», поскольку кровь (неразведенная) может убить микроорганизмы, а затем, через сутки или больше, пересевают на чашки Петри.

Посев мочи, промывных желудочных вод и других жидких материалов тоже имеет свои особенности, где для получения чистой культуры, жидкость сначала следует центрифугировать (условия – асептические!), а уж затем сеять, причем не саму жидкость, а ее осадок.

Культивирование и выращивание колоний осуществляют на чашках Петри или помещают сначала в жидкую среду, разлитую в стерильные флакончики, а затем изолированные колонии еще раз высевают, но уже на скошенный агар и помещают материал на сутки в термостат. Убедившись в чистоте полученной культуры, штаммы переносят на предметное стекло, делают мазок и окрашивают по Граму (чаще всего), Цилю-Нильсену и др. и для дифференцировки изучают морфологию микроба под микроскопом:

• Размер и форму бактериальной клетки;
• Наличие капсул, жгутиков, спор;
• Тинкториальные свойства (отношение микроорганизма к окрашиванию)*.

*Читатель, вероятно, слышал о таком возбудителе, как бледная трепонема? Это – возбудитель сифилиса, а ее название (бледная) поэтому и появилось, что она плохо воспринимает краски и остается слегка розоватой при окрашивании по Романовскому. Микроорганизмы, невоспринимающие анилиновые красители называются грамотрицательными, а воспринимающие – грамположительные. Грамотрицательным бактериям придают розовый или красный цвет при окраске по Граму дополнительные красители (фуксин, сафранин).

Бак посев можно назвать древним анализом, однако его популярность от этого отнюдь не падает, хотя современная бактериология имеет возможности выделения не только штаммов, но и отдельной клетки из него, которая называется клоном. Однако для получения клона необходим специальный прибор – микроманипулятор, который в обычных лабораториях отсутствует, поскольку применяется, в основном, в научно-исследовательских целях (генетические исследования).

1. Микробиологические исследования

1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Критерии чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Успех химиотерапии во многом зависит от правильного выбора соответствующего лечебного препарата, для чего крайне важно располагать сведениями о чувствительности возбудителя болезни к избираемому для лечения препарату.

В клинической практике чувствительными к препарату считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. В соответствии с этим критерии чувствительности микроорганизмов зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы препарата, его фармакокинетики и токсичности.

Мерой чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам при постановке лабораторного теста является минимальная концентрация препарата, ингибирующая рост возбудителя заболевания при стандартных условиях постановки опыта. Деление микроорганизмов на устойчивые и чувствительные производится на основании соотношения минимальной ингибирующей рост микроба концентрации препарата, определенной в лабораторных условиях, концентрации этого же препарата, создаваемой в очаге инфекции при введении терапевтических доз. При соотношении

можно говорить о чувствительности микроорганизма к данному химиотерапевтическому препарату.

Для клинической практики целесообразно делить микроорганизмы по степени чувствительности к химиотерапевтическим препаратам условно на 4 группы:

1-я группа — "чувствительных" микроорганизмов, когда обычно применяемые дозы препарата являются достаточными для достижения лечебного эффекта при общих заболеваниях;

2-я группа — "средне чувствительных" микроорганизмов, когда только повышенные дозы препарата могут обеспечить лечебный эффект при общих заболеваниях;

3-я группа — "умеренно устойчивых" микроорганизмов, когда лечебный эффект может быть достигнут только при локализации инфекционного очага в месте, где препарат концентрируется, или если препарат может быть введен непосредственно в очаг инфекции;

4-я группа — "устойчивых" микроорганизмов, когда нельзя рассчитывать на лечебный эффект.

Особенно важно определять чувствительность возбудителя заболевания к химиотерапевтическим препаратам:

— при процессах, вызванных микроорганизмами часто устойчивыми к лечебным препаратам;

— при затяжных инфекциях, когда сопротивляемость макроорганизма нарушена и выбор наиболее активного препарата играет особо важную роль;

— при применении препаратов, к которым во время лечения быстро развивается устойчивость (стрептомицин, рифампицин и некоторые другие.

В настоящее время предложены критерии чувствительности микроорганизмов только для некоторых антибиотиков (табл.1). Для других химиотерапевтических препаратов критерии чувствительности разрабатываются.

Классификация микроорганизмов по степени чувствительности к антибиотикам (МИК в мкг/мл или ед/мл)

Препараты тетрациклинового ряда

Примечания: +) — критерии чувствительности относятся ко всем лекарственным формам указанного антибиотика.

х — группа не установлена.

Взятие материала для выделения возбудителя заболевания и определения его чувствительности к лекарственным препаратам

Важным условием соответствия результатов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам и клинической эффективности последних является исследование чувствительности чистых культур истинных возбудителей инфекции, а не сопутствующей им микрофлоры. Поэтому при взятии материала для исследования следует соблюдать следующие правила:

1. Материал должен быть получен до начала антибактериальной терапии или через такой период после введения антибактериального препарата, который необходим для его элиминации из организма больного.

2. Материал для посева при определении чувствительности следует брать непосредственно из очага инфекции с соблюдением правил асептики (стерильными инструментами, в стерильную посуду и т.п.).

3. В тех случаях, когда взятие материала непосредственно из очага инфекции невозможно, но он сообщается с внешней средой, можно производить исследование соответствующего отделяемого: мочи при пиелонефрите, мокроты при воспалительных процессах в легких, отделяемого цервикального канала при сальпингоофоритах и т.д. Перед сбором материала для посева следует провести предварительную обработку антисептическими растворами доступных для этого полостей или поверхностей человеческого организма, по которым проходит исследуемый материал.

Например, при сборе мокроты больной должен утром до еды почистить зубы, прополоскать рот слабым раствором антисептика и затем откашлять мокроту в стерильную карманную плевательницу или прокипяченную баночку с крышкой. При этом больному надо объяснить, что он не должен собирать носоглоточную слизь и слюну, а должен стараться собрать только отделяемое дыхательных путей. Если мокрота отделяется плохо, больному следует накануне назначить отхаркивающее.

Мочу для посева после тщательного туалета наружных половых органов 0,5% раствором марганцевокислого калия берут стерильно катетером или получают ее при естественном мочеиспускании, отбросив первую небольшую порцию ("первую струю").

4. Посев материала, взятого у больного, производят на соответствующий набор питательных сред, необходимых для выделения чистых культур различных видов микроорганизмов. В смешанной культуре производить определение чувствительности к антибактериальным препаратам не следует, так как скорость роста различных микроорганизмов, присутствующих в ассоциациях, неодинакова и при подобном методе исследования определяется чувствительность к антибактериальным препаратам наиболее быстро растущих видов, не всегда являющихся возбудителями заболеваний. Кроме того, при определении чувствительности бактерий в смешанных культурах можно получить ложные результаты за счет микробного антагонизма, когда рост одной культуры может быть подавлен не антибактериальным действием препарата, а вследствие антагонистического влияния другой культуры.

5. Если в исследуемом материале находится несколько видов условнопатогенных микроорганизмов, необходимо выяснить, какой из них является ведущим в данном патологическом процессе.

Ориентировочные данные можно получить при использовании метода количественного учета обсемененности материала, например, определение степени бактериурии при пиелонефритах — преобладание в моче одного вида микроорганизмов может свидетельствовать о его этиологической роли в данном процессе.

С этой же целью проводится бактериоскопическое исследование материала, нацеливающее бактериолога на определенную флору, которую он должен будет получать, применяя селективные и элективные среды. Например, в мокроте больного пневмонией при бактериоскопии обнаружены в большом количестве пневмококки и в значительно меньшем — стрептококки и стафилококки. При первичном посеве мокроты пневмококки могут не вырасти совсем или вырасти в относительно небольшом количестве. Однако, бактериолог, ориентированный по мазку из посевного материала, приложит усилия для выделения и определения чувствительности к антибактериальным препаратам именно пневмококков.

6. Если выяснение истинного возбудителя не удается, или патологический процесс вызван микробной ассоциацией, исследуется раздельно чувствительность к антибактериальным препаратам всех членов, выделенных в чистой культуре.

7. В некоторых случаях, например, при раневой гнойной инфекции или термических осложненных ожогах, когда процесс вызывается ассоциацией микроорганизмов, практикуется определение чувствительности сразу всей ассоциации. Однако, эти данные надо рассматривать как сугубо ориентировочные, которые необходимо дополнить исследованием чувствительности раздельно у каждого из членов ассоциации.

8. В отдельных случаях определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам может проводиться при первичном посеве материала на питательные среды. Это возможно тогда, когда возбудитель находится в исследуемом материале и в достаточно большом количестве (например, в гное из закрытых очагов).

Выбор методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в настоящее время может проводиться методом диффузии в агар с применением бумажных дисков или методом разведений, представленным двумя модификациями — метод разведений в плотной питательной среде и метод разведений в жидкой питательной среде. Применяются также и ускоренные методы определения чувствительности, среди которых есть как методы диффузии, так и методы разведений.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории, выполняющей исследования.

Метод диффузии в агар с применением дисков следует расценивать как метод качественный. Благодаря простоте, скорости и легкости исполнения он является основным при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам практическими лабораториями.

Метод разведений — наиболее точный количественный метод. Он должен применяться в научно-исследовательской работе, при проведении международных исследований, а также в особенно важных случаях в лабораториях областных, краевых и республиканских санэпидстанций и в некоторых лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Методом разведений в плотной питательной среде рациональнее пользоваться при необходимости исследовать одновременно большое количество культур, так как на чашку с плотной средой можно посеять одновременно несколько штаммов. Необходимо отметить также большую точность метода разведений в плотной среде, при котором определяется чувствительность к препарату большинства вариантов микробной популяции, в то время как при использовании жидкой среды определяется чувствительность наиболее устойчивых вариантов.

Ускоренные методы служат дополнением к основным вышеназванным методам.

Определение чувствительности микроорганизмов к сульфамидам затруднено тем, что большинство питательных сред, применяемых для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, для этих препаратов не годится: эти среды содержат значительное количество метаболитов, которые являются антагонистами сульфамидов (РАВА, фолиевая кислота и т.п.). Поэтому определение чувствительности микробов к сульфамидам производят методом разведений на специальных средах. Для определения чувствительности к сульфамидам энтеробактерий рекомендуется среда Биргера и Зац, а бактерий кокковой группы — среда Ланди, которые могут применяться как жидкими, так и агаризированными. В связи с существованием перекрестной устойчивости микроорганизмов к большинству сульфамидов при определении чувствительности возбудителей к этим препаратам достаточно проверить чувствительность к одному какому-либо сульфамиду — например, норсульфазолу.

Для облегчения сравнения полученных результатов и их правильной оценки необходимо при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам любым методом обеспечить наиболее стандартные условия постановки опыта.

1.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков

Принцип. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и чашки инкубируют при 37°С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки роста — об устойчивости.

Компоненты.

1. Диски. Для исследования могут быть использованы только стандартные заводские диски. Во флаконах с дисками, пропитанными нестойкими к влаге антибиотиками, находится силикагель, который является хорошим влагоуловителем и показателем влажности во флаконе (при увлажнении силикагель меняет свою окраску с синей на розовую). Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в коричневый или розовый цвет, не используются. Диски хранят в сухом темном месте при температуре не выше 20°С. После вскрытия флакона дисками можно пользоваться не более месяца.

2. Питательные среды.

а) Среда на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, 1-2% агара, pH 7,2-7,4.

б) Казеиново-дрожжевая среда с таким же содержанием аминного азота и агара и значением pH.

в) Мясо-пептонная среда с таким же содержанием агара и pH.

В случае необходимости в среду может быть добавлено 5% крови или сыворотки, что отрицательного влияния на результаты анализа не оказывает.

Ход определения. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться. В качестве посевного материала может быть использована суточная бульонная культура (при интенсивном росте допускается использование 4-5-часовой культуры, при медленном росте — 2-3-суточной культуры) или 1-млрд-суспензии, приготовленной с агаровой культуры. 1 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

В тех случаях, когда допускается постановка теста с испытуемым материалом (гной, раневое отделяемое и др.), последний наносят на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности среды стерильным шпателем. Одновременно исследуемый материал засевают для выделения чистой культуры и последующей постановки теста с чистой культурой. При монокультуре исследование можно не повторять.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5-6). Диски накладывают на поверхность агара плотно для тесного контакта со средой, следя за тем, чтобы не были положены 2 сцепленных между собой диска. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона конденсационной водой, и инкубируют при 37°С в течение 18-ти часов. Если исследуемый вид микроорганизмов растет медленно, инкубацию продлевают до 48-72 часов или более, в зависимости от появления роста в контроле.

Оценка результатов. С помощью линейки или измерителя и миллиметровой бумаги определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Единичные колонии или тонкая пленка роста микроорганизмов внутри зоны задержки роста не учитывают. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм штамм расценивается как мало чувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику. В ответе должно быть написано, какой чувствительностью обладает исследуемая культура, а не размер зоны задержки роста.

1.1.2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом разведения в бульоне

Принцип. Готовят серию разведения антибиотиков в питательной среде и вносят в каждое разведение антибиотика исследуемую культуру. После определенного периода инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост изучаемого микроба.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептонный бульон или бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, pH 7,2-7,4. Если исследуемые микроорганизмы не растут на простых средах, допускается использование специальных сред, например, бульона Мартена для дифтерийных микробов, жидкой среды Сабуро для грибков и т.п.

2. Основные растворы антибиотиков. Порошок антибиотика (желательно стандарта антибиотика) взвешивают и растворяют в стерильной дистиллированной воде так, чтобы получить определенную концентрацию антибиотика. Удобной концентрацией для основного раствора является 2000 мкг/мл или ед/мл. Некоторые антибиотики не растворяются водой в такой концентрации, для них нужен специальный растворитель. Например, эритромицин и левомицетин растворяют в минимальном количестве этилового спирта, а затем разводят стерильной дистиллированной водой. Основные растворы антибиотиков стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 недели.

Подготовка к определению. Приготовление разведений антибиотиков. Разведение антибиотиков готовят путем разведения основного раствора антибиотика бульоном согласно представленной схеме (табл.2). Диапазон серии разведений зависит от установленных критериев чувствительности, она может быть начата и закончена на различных этапах. Пользуются отдельной пипеткой для приготовления основного раствора и его добавления к 1-й пробирке, затем отдельной пипеткой для каждой группы разведений: 2-3-4 пробирки, 5-6-7 пробирки и т.д. Полученные растворы антибиотиков разливают в стерильные пробирки по 1 мл. Для этого может быть использована одна пипетка — сначала разливают растворы более разведенные, затем более концентрированные. Можно готовить и двукратные разведения антибиотиков в бульоне в объеме 1 мл, но обязательно использовав отдельную пипетку для каждого разведения.

Ход определения. Для заражения применяют бульонную культуру в логарифмической или ранней стационарной фазе роста, т.е. для большинства видов микроорганизмов 18-часовую культуру. Для видов микроорганизмов, рост которых замедлен, используют 48-часовую культуру. Можно пользоваться агаровыми культурами. Культуру стандартизуют и разводят бульоном до 10 -10 м.т./мл. 1 мл такой культуры добавляют к 1 мл каждого разведения антибиотика, при этом антибиотик разводится еще в два раза (таблица 2). После заражения пробирки инкубируют при 37°С в течение 16-20 часов или более в зависимости от появления роста в контроле.

Контрольная пробирка содержит 1 мл бульона без антибиотика и 1 мл культуры для каждого испытуемого штамма.

Схема приготовления разведений антибиотиков для метода серийных разведений в бульоне

Указания для приготовления разведения антибиотиков

Концентрация антибиотика в полученном р-ре в ед/мл или мкг/мл

Окончательная концентр. антибиотика в мкг/мл или ед/мл в смеси 1 мл инокулята в бульоне