Анализ рск что это

Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.

В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля , ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).

РА — определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА — более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА — основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ — реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH — способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА — используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА — используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА — лантанидный иммунофлюоресцентный анализ — используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.

Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 3-5 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.

Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни , что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.

Структура ответа. Методы серологической диагностики, суть. Правила забора крови. Трактовка результатов. Парные сыворотки.

Более новые статьи:

• Патогенетическая терапия инфекционных больных — Виды патогенетической терапии, группы препаратов, примеры заболеваний — 17/08/2012 07:55

Серологическое исследование, или, другими словами — серологический анализ, это исследование биологических материалов в лаборатории. Этот анализ позволяет установить наличие болезнетворных бактерий в исследуемом организме, либо — в продуктах, которые проходят контрольную проверку.

Серологические методы диагностики

Исследование сывороток или других биологических объектов (молока, желчи, слюны, смывов слизистой кишечника, а также — копроматериалов) дает достаточно достоверное представление об ответе организма на внедрение инфекционного агента. Следует отметить, что применение серологических методов исследования имеет не только диагностическое значение, но дает достоверные сведения об уровне защиты организма, состоянии популяционного иммунитета, циркуляции различных типов в обследуемом регионе. Результаты серологических обследований могут также дать информацию для оптимизации антигенного состава профилактических препаратов и использоваться с целью оценки иммунологической эффективности вакцин.

Однако нужно отметить, что необходимость исследования парных сывороток крови, забираемых с интервалами 1,5-2 недели, и наличие экспрессных методов диагностики снижают диагностическую ценность серологических реакций.

Поэтому традиционные серологические тесты — реакции связывания комплемента (РСК) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), находят в настоящее время лишь ограниченное применение. Тем не менее простота этих методов, доступность и дешевизна реагентов делают их еще применимыми в лабораторной практике. Постановка РСК и РТГА осуществляется по общепринятым методикам.

Примером использования РСК для изучения поствакцинального иммунитета является работа К. Мидхана (1989 г.). При обследовании сывороток от 116 детей в возрасте 5 месяцев достоверные сероконверсии, по данным РСК, были отмечены в 44% случаев, а по результатам реакции нейтрализации (PH) и имму-ноферментного анализа (ИФА) — в 83 и 96% соответственно.

Исследование иммунитета

С целью изучения популяционного иммунитета с помощью РСК нами было обследовано 1246 сывороток больных ОКЗ в возрасте от нескольких месяцев до 80 лет и старше. Показано, что среднегеометрические титры комплементсвязывающих антител были наиболее высокими в возрастных группах 2 — 4 и старше 60 лет, что подтверждает полученные нами ранее данные о наибольшем распространении ротавирусной инфекции среди лиц указанных возрастных групп.

Анализ на ротавирус

РТГА используется в изучении ротавирусной инфекции чаще, чем РСК, и, как правило, в сочетании с другими лабораторными тестами. Так, Andrade J. Р. et al. применили РТГА, иммуно-блот, блок ИФА для изучения антител к структурным белкам ротавируса VP2, VP4, VP6 й VP7. По данным авторов, у детей от 2 до 4 лет обнаружили антигемагглютинирующие антитела к ротавирусам в 70-80%.

В зависимости от уровня антител к определенным белкам, по данным РТГА, авторы выделили 4 группы лиц. В I и II группы (60%) вошли дети с высоким уровнем антител к VP4 и VP7 и были классифицированы как «иммунные». В III группу (4%) отнесены лица с низким уровнем антител к VP7 и VP6, так называемые «частично иммунные». Дети IV группы (36%), у которых, по данным РТГА, антитела не были обнаружены, обозначены как «неиммунные» и составили группу риска, т. к. среди них возможно развитие выраженной ротавирусной инфекции. Следует отметить, что в данном наблюдении показатели чувствительности РТГА и блок ИФА были вполне сопоставимы.

РТГА неоднократно использовали для изучения структурного белка VP4. Исследования показали, что его гемагглютинирующая активность специфически ингибируется антисывороткой, тем самым подтверждая, что VP4 является гемагглютинином ротавирусов. Аналогичные данные были опубликованы ранее М. Езекиелем (1995 г.).

Таким образом, представленные работы показывают, что РСК и РТГА все еще применяют при изучении ротавирусной инфекции, однако эти методы носят вспомогательный характер и должны дублироваться другими тестами.

Нейтрализационные тесты

Реакция нейтрализации основана на способности иммунных сывороток человека или животных нейтрализовать репродукцию вируса и тем самым предотвратить связанные с этим феноменом проявления. В зависимости от биологической модели этими проявлениями могут быть: развитие заболевания со специфической клиникой, репродукция и выделение вируса, выработка специфических антител, а также появление цитопатического эффекта или образование пляк при использовании культуры клеток.

Макробиологические модели в настоящее время применяются преимущественно в ветеринарии, обнаружение вирусов у людей в большинстве случаев проводится на культуре клеток, как первичных, так и переливаемых. Методы PH подразделяются на две группы по принципиальной схеме постановки. В одной группе методов неразведенная сыворотка соединяется с серийными разведениями вируса, в другой — разведения сыворотки испытываются с постоянной дозой вируса. Для постановки реакции нейтрализации предпочтителен возбудитель, вызывающий выраженный цитопатический эффект или интенсивно репродуцирующийся в биологической модели.

Однако ротавирусы, к сожалению, обладают слабо выраженным цитопатическим эффектом, что убедительно продемонстрировали исследователи под руководством Б. Вебера (1992 г.). Исследование 121 пробы кала больных ОКЗ детей с использованием классического метода выделения вируса на клетках МА-104 под контролем ЦПД выявило только 4 положительных случая (3,3%), тогда как применение современных методов обнаружения ротавирусов (ИФА, ПЦР, ЭФ в ПААГ) позволило повысить этот показатель до 54,4%. Следовательно, для повышения чувствительности PH требуются дополнительные методические приемы, способствующие визуализации редукции вируса, в качестве которых используются: радиоактивная или иммунофлюоресцентная метка, плякобразо-вание, иммунопероксидазная окраска и т. д. При этом следует отметить, что сам принцип определения уровня вируснейтрализующих антител идентичен классическому методу PH, отличаясь от него только способом разрешения, то есть, визуализацией вируснейтрализующей активности сыворотки. В этом случае активность сыворотки определяют по ее способности подавлять проявления инфекционных свойств вируса.

В настоящее время в большинстве исследований используются два метода измерения количества вируснейтрализующих антител к ротавирусу. Один из них основан на подсчете числа индивидуальных вирусинфицированных клеток (метод пляк), специфически связывающихся с антителами, конъюгированными флюоресцентом. В другом тесте об уровне нейтрализации вируса судят по снижению продукции вирусного антигена им-муноферментным методом. Сравнительное изучение обоих методов показало линейную зависимость между показателями ИФА и числом пляк-формирующих единиц для каждого прото-типного штамма серотипа ротавируса: Wa, DS-1, Р, VA-70. Полученные данные позволяют легко определить разведение сыворотки, обеспечивающее нейтрализацию 60% инфекционного вируса (нейтрализующий титр антител). Оказалось, что титры антител при тестировании материалов обоими методами одинаковы и оба теста не различаются по воспроизводимости результатов. Некоторое преимущество метода с использованием антител, меченных флюоресцеином, по мнению авторов, заключается в большей объективности учета результатов (автоматизированная регистрация) и в меньшей трудоемкости.

Для измерения титров вируснейтрализующих антител используют и модифицированную PH посредством блокирования ИФА с помощью моноклональных антител.

• изучению интенсивности выработки вируснейтрализующих антител (ВНА) при естественной инфекции и вакцинации;
• образованию ВНА к различным структурным белкам ротавирусов;
• оценке роли ВНА сывороток крови и секреторных антител слюны и слизистой кишечника в защите от естественной инфекции (Ward R. et al., 1990, 1992, 1993, 1995, 1997).

В заключение необходимо подчеркнуть, что реакция нейтрализации в различных ее модификациях до настоящего времени широко используется как в экспериментальных, так и клинических исследованиях и, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, служит эталоном для всех других серологических методов.

Преципитационный анализ

Преципитационные тесты основаны на взаимодействии сыворотки с вирусными антигенами при помощи осмотических процессов или под влиянием электрического поля в гелевой среде или другого вида носителя. Одним из таких методов является реакция встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Авторы исследовали сыворотки крови здоровых и больных ротавирусной диареей взрослых и детей, а также препараты специфического иммуноглобулина на наличие антител к человеческому ротавирусу методом ВИЭФ в 7% агарозе с добавлением 4% полиэтиленгликоля. Оказалось, что антитела к RV циркулировали достаточно широко и обнаружены у больных взрослых и детей в 90,2-87,7% соответственно, а также у 78,4% здоровых детей в возрасте до 1 года. Все 32 серии иммуноглобулина содержали антитела к РВ в титрах 1:4- 1:128. По мнению авторов, метод пригоден для изучения популяционного иммунитета.

Радиоиммунопреципитация

Другой преципитационной методикой является радиоиммунопреципитация. Авторы использовали этот метод для изучения иммунного ответа к структурным и неструктурным белкам при первичной ротавирусной инфекции и показали, что иммунный ответ был более выражен к VP4, чем к VP7.

При изучении сывороточного и секреторного иммунологического ответа на применение тетравалентной реассортантной вакцины у новорожденных Для этого была использована радиоиммунологическая техника исследования наряду с ИФА и PH. При этом было показано, что иммунный ответ в сыворотке зависит от дозы вводимого антигена; что же касается выявления антител в слюне, то авторы объясняют их появление с потреблением грудного молока.

Реакция радиоиммунопреципитации используется и в тонких научно-исследовательских работах. Так, Дж. Тоссер использовал этот метод для изучения топологии белка VP6 в структуре генома и высказали предположение, что VP 6 участвует в образовании каналов внутреннего капсида.

Другие исследователи в 1994 году также использовали метод радиоиммунопреципитации для изучения иммунологических сдвигов при ротавирусной инфекции. Авторы показали, что в остром периоде регистрируются, главным образом, IgA к VP2 и VP6, в то время как в период реконвалесценции снижалась интенсивность выработки секреторных антител (IgA) не только к VP2, но и к остальным структурным и неструктурным белкам. Позднее аналогичные данные были получены с применением радиоиммунопреципитационного метода. Авторы показали, что в иммунологическом процессе, помимо VP4 и VP7, участвуют также VP2, VP6 и NSP2.

Таким образом, иммунопреципитация использовалась в диагностических целях для изучения иммунного ответа при естественной ротавирусной инфекции.

В последние годы иммунопреципитацию заменил метод радиоиммунопреципитации, который применяется для оценки поствакцинального и постинфекционного иммунитета при RV инфекции и для тонких научно-исследовательских разработок.

Гибридизационные методы

Для определения антител к ротавирусам широко применяют метод иммуноблота. Примером использования Western-blot в диагностике ротавирусной инфекции служит работа Х. Ушижимы (1989 г.), который, с помощью иммуноблотинга, охарактеризовал специфичность антител к структурным белкам RV у 21 ребенка с ОКЗ, а также уровень копроантител классов IgA и IgG к этим белкам у неинфициро-ванных детей. Авторы высказали предположение, что иммуно-блотинг может позволить установить диагноз заболевания по одной пробе копроантител без исследования парных сывороток крови. Возможность применения Western-blot для определения уровня антител к VP1, VP2, VP4, VP6 и VP7 была продемонстрирована Павловым И. и др. (1991 г.). Авторы исследовали сыворотки крови людей и животных на наличие антител к штаммам ротавирусов SA-11, DS-1, Wan Ito и пришли к выводу, что Western-blot может быть с успехом использован для оценки иммунитета в клинической практике.

Полагают, что иммуноблот может быть использован для подтверждения диагноза ротавирусной инфекции без использования парных сывороток по одной пробе копроантител.

Наряду с РТГА и ИФА, иммуноблот использовали для изучения популяционного иммунитета. Обнаружена группа лиц, неиммунных по отношению к VP2, VP4, VP6 и VP7, которые представляют группу риска, в первую очередь требующую защиты средствами активной и пассивной иммунизации (Andrade J. Р. et al., 1996).

Применение иммуноблота в изучении серологических сдвигов в процессе естественной RV инфекции отмечают и Begue R. et al. (1998). Авторы подтвердили, что в иммунном ответе на инфицирование участвуют наиболее часто антитела к VP2 и VP6, менее часто — к VP7 и VP4.

Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресцентный метод в непрямом варианте с использованием антивидовых сывороток, меченных флюорохромом, применяется для титрования испытуемых сывороток на клетках, зараженных ротавирусами. В основе реакции лежит специфическое взаимодействие меченых антител и гомологичного антигена, при этом комплекс антиген-антитело легко обнаруживают с помощью люминесцентного микроскопа.

Используя этот метод, авторы провели серологическое обследование двух групп южно-американских индейцев и выявили высокий процент серопозитивных лиц в обеих группах: 67,8 и 77,4% по данным ИФА и 45,5 и 56,7% по результатам ИФМ соответственно.

В другом исследовании, посвященном определению уровня антител к RV группы С в пуповинной крови с помощью ИФМ, было показано, что у 30% женщин детородного возраста выявлялись эти антитела, свидетельствующие о перенесенной инфекции.

Иммуноферментный анализ используется в настоящее время наряду с PH в серологической диагностике ротавирусной инфекции чрезвычайно широко. Этот метод, основанный на использовании антител или антигена, меченных ферментом, благодаря простоте выполнения и экономичности наиболее приемлем и перспективен для серологической диагностики ротавирусной инфекции. Метод позволяет проводить массовые сероэпидемические обследования населения, оценивать иммунологическую и эпидемиологическую эффективность вакцин, изучать защитную роль антител различных классов в различных биологических жидкостях человеческого организма, а также осуществлять серологическую диагностику ротавирусной инфекции.

Многочисленные исследования с помощью ИФА были проведены Р. Азередо (1989 г.), которые показали, что число больных ОКЗ установленной ротавирусной этиологии было значительно ниже уровня их инфицированности по результатам серологического обследования. Эти данные обнаружили, что многие клинические случаи ротавирусной инфекции не диагностируются методом обнаружения RV в фекалиях. Дальнейшие исследования по изучению распространенности ротавирусной инфекции подтвердили это предположение. При проведении сероэпидемиологических обследований было обнаружено, что 50- 70% населения обладали высоким уровнем антител, что свидетельствует о широкой циркуляции RV в человеческой популяции.

Еще большие возможности открывает ИФА при определении динамики уровня антител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов. Так, по данным авторы методики в 1989 году утверждают, что в процессе вакцинации достоверный прирост антител к RV в крови отмечался в 83-96%. Антиротавирусные антитела классов IgA и IgG одинаково хорошо выявляли ИФА и PH по редукции пляк — 67,6 и 70,0% соответственно. Сероконверсия антител класса IgM была обнаружена у 53 и 44% детей методами ИФА и РСК соответственно. По результатам анализа интенсивности выработки антител разных классов авторы сделали вывод, что наиболее эффективным, простым и быстрым методом выявления сероконверсий после вакцинации является способ обнаружения IgA антител с помощью ИФА.

Этот вывод нашел свое подтверждение и в работе Р. Бишопа (1996 г.), в которой указано, что по результатам обследования 68 пар мать-дитя с диагностированной RV инфекцией показано, что обнаружение антител класса IgA с помощью ИФА в копроматериалах служит наиболее чувствительным маркером как клинически выраженной, так и бессимптомной инфекции. Аналогичные результаты при обследовании детей с выраженной RV диареей были получены Дж. Коломиной в 1998 году.

Однако для изучения интенсивности сероконверсий необходимо исследование парных сывороток, что значительно удлиняет процесс диагностики. В то же время общеизвестно, что появление антител класса IgM является свидетельством начала инфекционного процесса. По нашим данным, полученным при обследовании больных ротавирусной инфекцией методами ИФА и РСК, оказалось, что, по результатам ИФА, все обследованные лица содержали в крови IgM антитела к RV, в то время как по данным РСК — только в 77% (Р

В последние годы с реализацией возможности определения гено- и серотипоспецифических антител ИФА стал поистине универсальным методом изучения ротавирусной инфекции, который используется:

• при изучении выработки антител классов IgA, М, G к отдельным структурным и неструктурным белкам RV;
• в оценке иммунологической эффективности различных видов вакцин: аттенуированных, холодоадаптированных, ДНК-овых, реассортантных;
• при изучении выработки антител в различных биологических жидкостях организма в условиях естественной инфекции и при иммунизации.

Таким образом, как следует из представленных данных, и иммунологические аспекты ротавирусной инфекции изучают при помощи широкого спектра лабораторных методов. Вследствие этого выбор оптимального метода исследования с учетом его разрешающей возможности, экономических и временных затрат достаточно сложен и зависит от задач, стоящих перед исследователями, а также оснащенности лаборатории. И все же из многообразия методов, на наш взгляд, следует выделить два — реакцию нейтрализации на культуре клеток и иммуноферментный анализ, — обеспечивающих изучение антител к различным классам иммуноглобулинов. Особую перспективность этих методов для использования в широкой практике определяет реализованная возможность экспресс-диагностики ротавирусной инфекции.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде — Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген — антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum — дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК — сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген — антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система — основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет — так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, — результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно — "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело — сыворотка больного

3. Комплемент — сыворотка морских свинок

4. Антиген — эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента — это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело — сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) — 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена — антигены специфический и контрольный в двойной дозе — на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом — гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это — рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро — и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод — РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере — 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз — сразу после водяной бани, второй — после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) — гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) — гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) — гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) — полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной — при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.

Диагностика является важнейшим этапом в лечении любого заболевания. В зависимости от правильно поставленного диагноза находится не только успешное лечение, но и возможность предотвратить развитие осложнений и сопутствующих патологий. Серологическое исследование что это такое? Это метод диагностического анализа биологического образца пациента на предмет наличия антител и антигенов. Тест позволяет выявить десятки заболеваний, фазу болезни и контролировать лечение.

Для чего назначается исследование

Этот тип медицинского исследования широко применяется в различных областях медицины. Реакция связывания комплемента или РСК направлена на выявление в сыворотке крови специфических клеток, антител, которые вырабатывает организм для борьбы с инфекциями и вирусами.

Изосерологическое исследование направлено на определение группы крови, резус-фактора и других параметров крови пациента.

• Серологический анализ крови используется в гинекологии для выявления заболеваний, передающихся половым путем. Также серологическое титрование используется для комплексного обследования будущих мам (токсоплазмоз, ВИЧ, сифилис и пр.). При постановке на учет беременных, это обязательный тест.
• В педиатрии серологические реакции применяются для подтверждения диагноза «детских» болезней (ветрянка, краснуха, корь и пр.), если симптомы выражены не ярко и нет возможности определить недуг по клиническим показаниям.
• Серологические исследования позволяют венерологам быстро и безошибочно ставить диагноз. При схожих симптомах и жалобах анализ крови позволяет выявить антитела к сифилису, лямблиозу, уреплазмозу, хламидиозу, герпесу и другим заболеваниям.
• Гастроэнерологи, гепатологи и инфекционисты используют серологический анализ крови для диагностики вирусного гепатита.
• Подозрение на любое инфекционное или вирусное заболевание может возникнуть у терапевта. Для подтверждения используются серологические реакции на специфические антитела в организме. Проводится анализ на энцефалит, бруцеллез, коклюш, вирус Денге, вирус иммунодефицита, аллергию и пр.
• Серологическая диагностика для госпитализации играет важную роль. Этот метод диагностики может показать, на какой стадии развития находится болезнь, и требуется ли немедленное оформление в стационар или достаточно амбулаторного лечения.

В качестве биологического материала для исследования может использоваться образец слюны и кала, но чаще всего используется венозная кровь пациента. Анализ для серологических реакций должен браться из локтевой вены в лабораторных условиях. Перед тем как сдать анализ следует проконсультироваться с лечащим врачом и подготовиться.

Подготовка к анализу

Этот тип исследования проводится как в муниципальных, так и в коммерческих учреждениях. Выбор лучше сделать в пользу той лаборатории, которая располагает самым современным оборудованием и имеет только положительные отзывы о своей работе. Для занятых пациентов лаборатория может предоставлять услуги по забору крови на РСК дома.

В этом случае пациенту не приходиться тратить время на дорогу, а очереди исключены.

Подготовка к забору венозной крови включает в себя несколько общих правил. Перед тестом нельзя употреблять пищу, то есть анализ берется натощак. Сдавая кровь необходимо находиться в состоянии спокойствия и не волноваться. Перед процедурой не следует проходить другие процедуры (рентгенография, ультразвуковое обследование и пр.). За несколько недель до забора крови по согласованию с лечащим врачом отменяется прием лекарственных препаратов. Некоторые рекомендации зависят от болезни, на которую проводится тест. Например, при исследовании на гепатит за 2 дня до анализа из рациона исключают жирную пищу и алкоголь.

Реакция флюоресценции

Один из видов серологических реакций флюоресценция или РИФ. Этот метод исследования проводится с использованием реагента, который подсвечивает искомые антитела в сыворотке крови. Для постановки серологической реакции прямого типа или ПИФ специфические антитела помечаются флюоресцирующим веществом. Это самый быстрый тип исследований, который проводится в один этап.

Другой способ, который называется непрямым или РНИФ, проводится в 2 стадии. На первой специфические клетки (антитела) не имеют флюоресцирующих меток, а на второй используются соответствующие меченые антитела для выявления комплекса антиген-антитело. Реакция свечения появляется только после связи со специфическим антителом. Результат манипуляций оценивается специальным прибором, который оценивает интенсивность излучения, а также определяет форму и размер исследуемых объектов. Инфекционный агент определяется с достоверностью 90-95% в зависимости от типа и стадии заболевания.

Иммуноферментный анализ

Для исследования ИФА серологические реакции проводятся с использованием уникальных стабильных реагентов. Вещества с меткой присоединяются к определенному (искомому) типу антител. В результате серология дает качественную или количественную оценку по образцу крови пациента. Если субстрат не имеет выраженных маркеров, результат считается отрицательным. В случае качественного исследования положительный результат означат только присутствие антител в биологическом образце.

Серодиагностика с количественным определением клеток антител дает более полную картину. По сумме выявленных клеток врач может сказать находится ли заболевание в начальной стадии, острой или это обострение хронической формы болезни. При постановке диагноза также учитывается киническая картина и жалобы пациента.

Особенности исследований

При исследовании на бруцеллез проводится контроль сыворотки крови на самозадержку без антигена. Это позволяет повысить достоверность теста. Результат анализа на бруцеллез может быть положительным, отрицательным или невыраженным, то есть вызывающим сомнения. При получении сомнительных результатов, рекомендуется повторный забор крови. Также бруцеллез диагностируется по результатам посева крови, исследования костного мозга и спинно-мозговой жидкости.

Достоинства и недостатки серологии

Диагностика с применением серологических методов широко используется в современной медицине. Особенно актуален этот тест при выявлении вирусных и инфекционных заболеваний. Этот же тип анализов используется при географических скринингах и медицинских обследованиях для предотвращения эпидемиологических вспышек.

Серологические анализы имеют ряд преимуществ.

• Серологический тест любого типа имеет высокую достоверность.
• Анализы на серологию проводятся достаточно быстро. Результат РСК известен уже через сутки, а получить его можно посредством интернета, не выходя из дома. В особых случаях при стационарном лечении тест проводится в течение нескольких часов.
• РСК позволяет контролировать развитие болезни, и отслеживать эффективность проводимого лечения.
• Серологические методы исследования отличаются невысокой стоимостью и доступны пациентам.

Серологические анализы имеют и некоторые недостатки. Для того, чтобы обследование дало максимально достоверную информацию анализ крови следует проводить с учетом времени инкубационного периода болезни.

Простой герпес 1 и 2 типа можно определить только спустя 2 недели после заражения, а исследование на вирус иммунодефицита проводится спустя 1, 3 и 6 месяцев после контакта с больным.

На достоверность исследования может повлиять человеческий фактор. Если пациент пренебрегает правилами подготовки к исследованию или лаборант допустил ошибку в обработке образца крови, возможно получение ложного или сомнительного результата. Такая ситуация возникает приблизительно в 5% случаев. Как правило, лечащий врач на основании клинических показаний легко вычисляет ошибку РСК.

Серологическое исследование крови современный и надежный способ выявления таких опасных заболеваний как ВИЧ, гепатит, бруцеллез, ЗППП и пр. Этот раздел медицины направлен на изучение плазмы крови человека и ее иммунологических свойств. Серологический метод широко распространен, а стоимость исследований в частных лабораториях сравнительно невысока. Для проведения анализа используется современное оборудование, которое сводит к минимуму влияние человеческого фактора на результаты исследований.