Детекция результатов пцр

В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR ) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце [1] .

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани [2] .

Содержание

Описание метода [ править | править код ]

Процедура очень похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление или денатурация двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления. Сегодня это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но, в обоих случаях флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы [3] .

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта ещё не очень много, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума [4] .

Количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресценция достигла порогового уровня (над шумом) называется СТ-величиной. Пороговый уровень — не строго определённая величина, может подбираться для каждого случая отдельно.

Однако СТ-величина может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра и так далее. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — таких генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (Пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле: [N ]_A/[N ]_B = (1+E) (CT_B-CT_A)

Где [N ]_A и [N ]_B — начальные количества двух образцов, CT_B и CT_А — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9 [4] .

Разнообразие зондов [ править | править код ]

Мечение двуцепочечной ДНК [ править | править код ]

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green.

Метка, работающая в фазу элонгации [ править | править код ]

Существует другой способ использования зондов, к которым с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии два химических реагента будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится [3] .

Метки, работающие в фазу отжига [ править | править код ]

Флуорогенная шпилька [ править | править код ]

Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать [пространственную структуру| вторичная структура ДНК] — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации [3] .

Метка, основанная на методе FRET [ править | править код ]

Другой вариант мечения вновь-образующегося ПЦР-продукта основывается на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать [3] .

Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).

ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции [ править | править код ]

Метод был изобретён для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизменённый количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях [5] .

Прежде, чем проводить стандартный ПЦР в реальном времени, нужно провести реакцию обратной транскрипции, для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию можно проводить без добавления праймера, однако наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Существует три основных типа праймеров:

1. Олиго dT праймеры — гибридизуются с polyA последовательностью, которая есть на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
2. Случайная последовательность. Обычно используют либо гексамеры, либо нонамеры. Такие последовательности могут транскрибировать все мРНК
3. Ген-специфичные праймеры используются, когда исследуется мРНК, экспрессируемая с определённого гена [4] .

Реакция обратной транскрипции — ключевой этап в данном подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.

Полуколичественная ПЦР [ править | править код ]

Полуколичественная ПЦР (semi-quantitative PCR) — немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или саузерн-блота, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов [5] .

Применение [ править | править код ]

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.

Диагностические исследования [ править | править код ]

Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний [6] . Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа [7] .

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита B [8] . Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев [9] . В зависимости от того, интегрировал ли вирус в геном пациента (как, например, в случае вируса папилломы человека) или нет, количественный анализ осуществляется с применением обратной транскрипции или без неё.

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей [10] [11] и даже при некоторых формах лейкемии [12] [13] .

Выявление циркулирующих опухолевых клеток [ править | править код ]

Рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии [14] .

В микробиологии [ править | править код ]

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения [15] . Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры [16] .

Научные исследования [ править | править код ]

В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется

кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК) [ править | править код ]

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру [17] .

ПЦР в реальном времени для измерения количества белка [ править | править код ]

Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:

1. Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК таким образом, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.
2. Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная нам последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа [18] .

Обнаружение фитопатогенов [ править | править код ]

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона [19] .

Детекция генетически модифицированных организмов [ править | править код ]

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генетически модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промотора, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре [20] [21] .

Выделение ДНК/РНК

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее — природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.

Постановка ПЦР

Для проведения ПЦР в реакционный буфер вводят определенное количество коротких (15-30 пар оснований) олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных последовательностям, фланкирующим участок ДНК, копию которого хотят получить. Праймеры подбирают таким образом, чтобы их 3′ -концы были ориентированы навстречу друг другу, т.е. синтезировался фрагмент ДНК, заключенный между праймерами. ПЦР проводят следующим образом: сначала реакционную смесь нагревают до температуры 90-94° С, вызывая этим денатурацию ДНК, затем температуру снижают до 50-65° С в зависимости от нуклеотидной последовательности праймеров, чтобы отжиг происходил в строго комплементарных участках, и, наконец, в смеси устанавливают температуру, оптимальную для работы ДНК-полимеразы. При воспроизведении этого цикла количество копий участка ДНК, находящегося между местами отжига праймеров, возрастает в логарифмической зависимости, т.е. от одной двухцепочечной молекулы можно получить 2n одноцепочечных копий, где "n" равно количеству циклов.

Применение термостабильных полимераз требовало выяснения зависимости их синтетической активности от условий реакции. Исследование связи активности фермента с температурой показало, чтонекоторую активность (несколько десятков пар оснований, включенных в синтезируемую цепь в течение одной минуты) можно наблюдать при комнатной температуре. Заметное увеличение активности наблюдалось при температурах 50-65° С, а от 65° до 75-79° С была установлена логарифмическая зависимость синтетической активности от температуры. Надо отметить, что на активность фермента оказывают влияние большое число факторов, и поэтому приведение точных данных о максимальной активности Taq-полимеразы затруднено.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, dNTP и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения .

Детекция продукта ПЦР

Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях или альтернативными технологиями. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. Полосы визуализируют с помощью ультрафиолетового подсвечивания в трансиллюминаторе и последующим фотографированием. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Положительный результат оценивают по расстоянию пробега визуализированной полосы, соответствующему полосе положительного контроля, что свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК, равного по размерам положительному контролю. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.

Дополнительные доказательства специфичности ампликона можно получить путем расщепления специфическими рестриктазными ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом. При жидкостно-фазной гибридизации зонд добавляется к амплификату, а затем производится электрофорез в геле. При твердофазной гибридизации амплификат фиксируется на мембране, а затем гибридизируется с зондом. Такое подтверждение специфичности в практической диагностике производится редко, по необходимости.

При определении амплифицированной ДНК методом Саузерн-блота и дот-гибридизации отмечено повышение чувствительности анализа, но для получения ответа требуется дополнительно 1-2 дня.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК является также высоконадежным методом доказательства специфичности, но применяется в основном для идентификации точечных мутаций генов.

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза) и другие.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

1. Урогинекология . Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
2. Неонатология . Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
3. Служба крови . Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
4. Клиника инфекционных заболеваний . К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
5. Фтизиатрия и пульмонология . ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

• Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
• Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
• Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
• Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
• Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
• Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

• Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
• Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
• Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
2. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
3. Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
4. Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
5. Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
6. Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
7. Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
8. Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
9. Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
10. Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
11. Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
12. Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цены на ПЦР-диагностику

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 [2] рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 [3] рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.