Антимикробные вещества бактерий

АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА ПРОБИОТИКОВ

Антимикробные вещества, синтезируемые пробиотиками

Известно, что антагонистическая активность кишечных бактерий обеспечивается как неспецифическими механизмами, такими как продукция короткоцепочечных жирных кислот и конкуренция за питательные вещества и сайты прикрепления к кишечному эпителию, так и синтезом бактериоцинов различных классов (F.A.C.Martinez, 2013). См. например: Антагонистическая активность бифидобактерий .

Защитные и иммунные функции кишечной микрофлоры (нормофлоры) направлены на поддержание колонизационной резистентности и микробного антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это обеспечивается антитоксическим и сорбционным действием нормофлоры и синтезируемыми бактериями веществами: секреторным иммуноглобулином IgA, короткоцепочечными жирными кислотами (КЖК), другими органическими кислотами, регулирующими внутрипросветный уровень рН, микробным лизоцимом (мурамидаза), перекисью водорода. Защитные свойства микрофлоры кишечника опосредованы также антибиотикоподобными микробными пептидными субстанциями – микроцинами, обладающими широким спектром антибактериальной активности и составляющими группу эндогенных антибиотиков, а также бактериоцинами.

Действительно, некоторые пробиотики обладают способностью синтезировать ряд антимикробных веществ. Во-первых это упомянутые выше короткоцепочечные жирные кислоты (молочная, уксусная, пропионовая и др.), угнетающие рост микроорганизмов, за счет понижения водродного показателя pH среды. Также к антимикробным метаболитам относится такое неорганическое соединение, как перекись водорода (H₂O₂).

Однако самыми высокоорганизованными антимикробными веществами являются бактериоцины и бактериоциноподобные вещества .

Бактериоцины устойчивы к высоким температурам, сохраняют активность в широком диапазоне pH. Данные вещества не имеют цвета и запаха. Бактериоцин способен образовывать поры в мембранах при низких концентрациях. Данные соединения подвержены диструкции со стороны протеолетических ферментов. Бактериоцины рассматривают перспективной альтернативой антибиотиков (Cotter et al., 2013). Бактериоцины обладают активностью к близкородственным штаммам продуцента (Cleveland et al., 2001; Kemperman et al., 2003; De Vuyst et al., 2007). Существуют бактериоцины со спектром действия на гнилостные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Основными широко используемыми в прикладных исследованиях в настоящее время бактерицинами являются: низин, бифидоцин Б, бифилонг, бифидин, плантарицин, лактоцин, диацетин и др.

Бактериоцины разделены на три основные категории: (Ермоленко, 2009)

1) Лантибиотики. Это небольшие пептиды (

2) Не содержащие лантионин термоустойчивые пептиды. Данный вид синтезируется на рибосомах, а далее происходит минимальная пост-трансляционная модификация. В данной группе выделяют три подвида: одинаковые пептиды, двупептидные бактериоцины, тиол-активированные пептиды.

3) Термочувствительные белки.

Существуют бактериоцины с липидными и углеводными компонентами.

Механизмы действия пробиотических бактерий

Пробиотические бактерии оказывают многочисленные и разнообразные действия на организм человека. На химус, патогенные бактерии, комменсальную микрофлору, энтероциты и иммунокомпетентные клетки пробиотики могут оказывать как прямое, так и непрямое действие, которое обусловлено изменениями в микробном биоценозе кишечника. Считается доказанным их конкурентное взаимодействие с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Некоторые пробиотики оказывают прямое воздействие на слизистую оболочку тонкой кишки, ее трофические и ферментативные резервы [6, 7, 9].

Разнообразные механизмы местного влияния пробиотических бактерий условно могут быть кластеризированы на три группы: 1) действие на патогенные бактерии; 2) на эпителий слизистой оболочки пищеварительного тракта; 3) действие на неспецифические механизмы защиты и иммунную систему [8, 11, 13, 14, 15].

Основные механизмы действия пробиотических бактерий:

1. Антимикробная активность:

• подавление адгезии патогенной флоры;
• повышение кислотности в просвете кишечника;
• продукция бактериоцинов и микроцинов;
• ингибиция бактериальной инвазии.

2. Улучшение барьерной функции слизистой оболочки кишечника:

• увеличение продукции слизи;
• поддержание целостности молекулярно-клеточного барьера.

• влияние на эпителиальные клетки;
• на дендритные клетки;
• на моноциты/макрофаги;
• на лимфоциты (Т-, В-лимфоциты, NК-клетки).

Бактерицидное действие пробиотических бактерий

Одним из механизмов пробиотических бактерий, посредством которого они препятствуют колонизации патогенными бактериями , является продукция сероводорода, перекиси водорода и различных кислот (уксусной, молочной, соляной, бензойной), обусловливающих снижение рН в просвете кишечника [16]. Во-вторых, пробиотики, продуцируя антимикробные молекулы, включая короткоцепочечные жирные кислоты, бактериоцины и микроцины, могут непосредственно ингибировать рост бактериальных и грибковых колоний или индуцировать гибель патогенов.

Антимикробные вещества, продуцирующие грамположительные бактерии, называют бактериоцинами, а те, которые продуцируют грам­отрицательные бактерии, — микроцинами [10,12,15]. Следует отметить, что все пробиотики: бифидобактерии Bifidobacterium, пропионовокислые бактерии Propionibacterium, лактобациллы Lactobacillus, бактерии рода Lactococcus, стрептококки вида Streptococcus thermophilus, относятся исключительно к грамположительным бактериям.

Бактериоцины (bacteriocins, греч. bakterio(n) — палочка и лат. caedere — убивать) — экзотоксины, специфические белки, синтезируемые некоторыми видами бактерий, которые токсичны для клеток других штаммов этого же или близких видов бактерий (прим.: вид бактерий — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода). Способность синтезировать бактериоцины и устойчивость (иммунитет) к ним контролируются плазмидами. Плазмиды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы.

Бактериоцины оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные патогенные бактерии, нарушают синтез бактериальной мембраны и обладают порообразующим действием, а микроцины ингибируют ферменты, участвующие в процессах синтеза функциональных бактериальных протеинов.

Прим.: Бактериостатической дозой называется наименьшая концентрация антибиотика, в присутст вии которой угнетает­ся видимый рост бактерий. Наимень­шая концентрация антибиотика, вызывающая полную гибель испытуемых бактерий, называется минимальной бактерицидной концентрацией.

Изучение бактериоцинов и микроцинов пробиотических бактерий в настоящее время только началось, однако стоит отметить, что перспективы очень большие:

Пробиотики выделяются синтезом бактериоцинов различных классов. Их антибиотическая активность давно известна и широко используется в пищевой промышленности как естественное средство против развития нежелательной микрофлоры в продуктах питания. Для этого в пищевые среды вносят специальные стартовые культуры микроорганизмов, культуральные жидкости и бактериальные закваски пробиотических бактерий с антибиотическими свойствами , а также др. продукты микробиологического производства с антимикробной активностью против патогенов различного класса.

В фармацевтике на микробные бактериоцины обращают пока недостаточное внимание (возможно, в силу малоизученности), хотя, возможно, именно они, действующие порой даже против лекарственноустойчивых штаммов (см.: L. parafarraginis против патогенов ), смогут дать начало новому поколению антибиотиков. Так например, классические молочные пропионовокислые бактерии могут производить бактериоцины, которые подавляют рост и выживаемость возбудителей (!) листериоза и иерсиниоза, а также, в отличие от лактобактерий, подавляют рост грам-отрицательных бактерий, дрожжей и плесневых грибов (Подробнее см.: Антимикробные свойства пропионовокислых бактерий ).

Подробнее по теме см. также:

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками. / Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11. 2009. №1. С. 157-167.
2. Cleveland J, Montville T, Nes I. Chikindas ML. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. / Int. J. Food Microbiol. 2001. V. 71. Р. 20.
3. Cotter P., Ross R., Hill C. Bacteriocins – a viable alternative to antibiotics. / Nat. Rev. Microbiol. 2013. V. 11. Р. 95-105.
4. De Vuyst L, Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. / J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 13. Р. 194-199.
5. Kemperman R, Kuipers A, Karsens H, Nauta A, Kuipers O, Kok J. Identification and characterization of two novel clostridial bacteriocins, circularin A and closticin. / Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. Р. 1589-1597.
6. Урсова Н.И. Пробиотики в комплексной коррекции дисбактериоза кишечника у детей / Н.И. Урсова [Текст] // Лечащий врач: Журнал для профессионалов в медицине. — 2008. — № 1. — С. 12-14.
7. Angelakis E. Related actions of probiotics and antibiotics on gut microbiota and weight modification / E. Angelakis, V. Merhej, D. Raoult [Text] // Lancet Infect. Dis. — 2013 Oct. — 13(10). — 889-99; doi: 10.1016/S1473-3099(13)70179-8.
8. Bermudez-Brito M. Probiotic mechanisms of action / M. Bermudez-Brito, J. Plaza-Diaz, S. Munoz-Quezada, C. Gomez-Llorente, A. Gil [Text] // Ann. Nutr. Metab. — 2012. — 61(2). — 160-74; doi: 10.1159/000342079.
9. Ciccarelli S. Management strategies in the treatment of neonatal and pediatric gastroenteritis / S. Ciccarelli, I. Stolfi, G. Caramia [Text] // Infect. Drug Resist. — 2013, Oct 29. — 6. — 133-161; doi: 10.2147/IDR.S12718.
10. Desriac F. Bacteriocin as weapons in the marine animal-associated bacteria warfare: inventory and potential applications as an aquaculture probiotic / F. Desriac, D. Defer, N. Bourgougnon, B. Brillet, P. Le Chevalier, Y. Fleury [Text] // Mar. Drugs. — 2010, Apr 4. — 8(4). — 1153-77; doi: 10.3390/md8041153.
11. Dongarra M.L. Mucosal immunology and probiotics / M.L. Dongarra, V. Rizzello, L. Muccio, W. Fries, A. Cascio, I. Bonaccorsi, G. Ferlazzo [Text] // Curr. Allergy Asthma Rep. — 2013 Feb. — 13(1). — 19-26; doi: 10.1007/s11882-012-0313-0.
12. Gillor O. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics / O. Gillor, A. Etzion, M.A. Riley [Text] // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2008 Dec. — 81(4). — 591-606; doi: 10.1007/s00253-008-1726-5..
13. Hoffmann D.E. Science and regulation. Probiotics: finding the right regulatory balance / D.E. Hoffmann, C.M. Fraser, F.B. Palumbo, J. Ravel, K. Rothenberg, V. Rowthorn, J. Schwartz [Text] // Science. — 2013, Oct 18. — 342(6156). — 314-5; doi: 10.1126/science.1244656.
14. Landy J. Commentary: the effects of probiotics on barrier function and mucosal pouch microbiota during maintenance treatment for severe pouchitis in patients with ulcerative colitis / J. Landy, A. Hart [Text] // Aliment. Pharmacol. Ther. — 2013 Dec. — 38(11–12). — 1405-6; doi: 10.1111/apt.12517.
15. Ng S.C. Mechanisms of action of probiotics: recent advances / S.C. Ng, A.L. Hart, M.A. Kamm, A.J. Stagg, S.C. Knight [Text] // Inflamm. Bowel Dis. — 2009. — Vol. 15, № 2. — P. 300-310; doi: 10.1002/ibd.20602.
16. Servin A.L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens / A.L. Servin [Text] // FEMS Microbiol. Rev. — 2004 Oct. — 28(4). — 405-40. PMID: 15374659.

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

В огромном многообразии химических веществ имеются вещества, тормозящие или полностью прекращающие рост микробных клеток. Эти вещества – так называемые дезинфектанты — оказывают либо микробоцидный (гибель микроорганизмов), либо микробостатический эффект (приостанавливает их рост, но после удаления этого вещества рост и развитие микроорганизмов вновь возобновляется).

Характер действия химического вещества зависит с одной стороны, от его природы, условий воздействия, а с другой – от вида и состояния микроорганизмов, против которых направлено его действие. В первом случае это химическая структура дезинфектанта, его доза, время воздействия, температура, рН раствора, возможность инактивации действующего начала, доступность уничтожаемых микроорганизмов и т.п.; во втором – уровень микробного загрязнения, фаза развития микроорганизмов, их индивидуальная устойчивость и возможные ее изменения.

Множество дезинфектантов с различными торговыми названиями относятся к сравнительно небольшому числу групп химических соединений. Из неорганических веществ сильным антимикробным действием обладают соли тяжелых металлов (ртути, меди, серебра), окислители (хлор, озон, иод, пероксид водорода, хлорная известь, перманганат калия), щелочи и кислоты (едкий натр, едкое кали, сернистая, борная, фтористоводородная кислоты), некоторые газы (сероводород, оксид углерода, диоксид серы, диоксид углерода). Вещества органической природы также оказывают губительное действие на микроорганизмы. Из органических веществ наиболее часто используют спирты, фенолы, альдегиды и другие соединения и их производные.

По механизму действия наиболее употребляемые химические соединения можно классифицировать как повреждающие белковые структуры, воздействующие на цитоплазматическую мембрану, влияющие на синтез вещества клеточной стенки, воздействующие на молекулы ДНК. Механизм действия антимикробных веществ различен и зависит от их природы. Например, спирты и эфиры растворяют липиды цитоплазматической мембраны, вследствие чего нарушается ее транспортная функция и нарушается жизнедеятельность клетки. Соли тяжелых металлов, формалин вызывают быструю коагуляцию белков протоплазмы, фенолы – инактивацию ферментов дыхательной цепи, кислоты и щелочи – гидролиз белков. Хлор и озон, обладающие сильным окислительным действием, также инактивируют ферменты.

Для достижения нужного эффекта важно правильно подобрать дозу (концентрацию) дезинфектанта. Малые дозы антимикробных веществ часто не дают желаемого эффекта. Более того, низкие концентрации способствуют адаптации, появлению устойчивых форм и часто стимулируют развитие микроорганизмов. Однако это не означает, что сверхвысокие концентрации обеспечивают дополнительные преимущества. Нерационально высокие дозы приводят к дополнительным финансовым затратам и увеличивают риск возникновения поражений кожных покровов и глаз у персонала. Поэтому крайне важно придерживаться концентраций, рекомендуемых производителями дезсредства.

Необходимое время воздействия дезинфектанта зависит от его природы, от состава микробиоты обрабатываемого материала, состояния его поверхности, температуры и концентрации раствора. При низких температурах, концентрациях и затрудненном доступе к микроорганизмам (например, при наличии на обрабатываемой поверхности механических загрязнений) для достижения нужного эффекта требуется больше времени. При одинаковых условиях грамотрицательные бактерии погибают медленнее, чем грамположительные. Медленнее нейтрализуются кислотоустойчивые микроорганизмы. Споры микроорганизмов, особенно бактерий гораздо устойчивее, чем вегетативные клетки. Быстрым действием обладают хлор и этиловый спирт. На чистой поверхности они дают результат уже через 2 минуты. Однако,его недостаток состоит в том, что он инактивируется слизью и гноем. Спирт эффективен при концентрации 70% в отношении бактерий, не образующих спор. Спирт не вызывает гибели спор. Этанол концентрацией 70% используется также для дезинфекции рук. Дезинфицирующее действие этанола ослабляется в присутствии большого количества органических веществ. При обработке предварительно не очищенного оборудования эффект воздействия равен нулю.

С повышением температуры токсичность многих антимикробных веществ, как правило, возрастает. Температура влияет не только на активность самого вещества, но и на микроорганизмы. При температурах, превышающих максимальную для данного микроорганизма, даже небольшие дозы таких веществ вызывают их гибель.

Некоторые дезинфектанты чувствительны к изменению рН. Так например, некоторые виды глутаральдегидов эффективны при рН 8,0 ед, хлоргексидин более активен при разбавлении жесткой водопроводной водой при 7,2 ед., чем при разбавлении дистиллированной с рН 6,0 ед. Зависимость эффективности средства от величины рН необходимо строго контролировать и неукоснительно следовать рекомендациям по его применению.

Дезинфицирующий раствор должен соприкасаться с микроорганизмами, которые необходимо уничтожить. Под слоем механических загрязнений микроорганизмы остаются вне зоны доступа дезсредства и эффективность процедуры резко снижается.

Практически все химические дезинфектанты могут инактивироваться определенными материалами. К таким материалам относятся мыло, моющие средства, другие дезинфектанты, органические природные материалы, в том числе пищевые продукты, жесткая вода, искусственные материалы. Мыло является щелочным средством, моющие средства могут быть щелочными, нейтральными или кислотными. Мыло и щелочные средства инактивирую дигуаниды и четвертичные аммонийные соединения. Кислотные инактивируют щелочные, такие как фенолы или соединения хлора. Очень часто один дезинфектант вызывает инактивацию другого, поэтому не рекомендуется использовать два дезинфектанта или один сразу же после другого. Единственное исключение из этого правила – этиловый спирт, который можно эффективно использовать одновременно с другими дезсредствами. Продукты питания способны в значительной степени инактивировать соединения хлора и четвертичные аммонийные соединения, амфолиты, в меньшей – фенолы. Жесткая вода способна инактивировать четвертичные аммонийные соединения и амфолиты, в меньшей степени она действует на фенолы и соединения хлора. Другие органические материалы, например, натуральная пробка инактивирует амфолиты, фенолы, хлоргексидины. Другие целлюлозные материалы, такие как дерево, вата, бумага инактивируют амфолиты, четвертичные аммонийные соединения, дигуаниды и в меньшей степени фенолы. Резина способна воздействовать на фенолы и дигуанидины. Из искусственных материалов особого внимания заслуживают пластмассы. Число пластмасс, используемых в оборудовании, постоянно растет, а их химическая природа постоянно меняется вследствие использования различных добавок. Установлено, что нейлон, полиуретан, полиэтилен, полипропилен, стирол, поливинилхлорид и поливинилацетат инактивируют некоторые дезинфектанты.

К различным антимикробным веществам один и тот же микроорганизм проявляет разную степень устойчивости. Одно и то же вещество может оказывать неодинаковое действие на различные виды микроорганизмов – одни вызывают быструю гибель, другие приостанавливают их развитие, третьи могут вообще не оказывать действия. Это зависит от наличия у микробных клеток спор и капсул, устойчивых к химическим веществам. Антимикробные вещества значительно сильнее действуют на вегетативные клетки, чем на споры, поэтому при дезинфекции уничтожаются, в основном, вегетативные клетки.

Уровень устойчивости микроорганизмов к дезинфектантам не остается неизменным. Устойчивость зависит от условий, в которых находятся клетки. Подвергаясь длительному воздействию определенного дезинфектанта, микроорганизмы постепенно приобретают резистентность к его воздействию. Эта резистентность сохранится или даже будет увеличиваться до тех пор, пока они будут находиться или соприкасаться с дезинфицирующей средой. Повышенная резистентность к дезинфектантам является временной, непостоянной и избежать ее можно только своевременной заменой одного дезсредства другим.

На результат дезинфекции оказывает воздействие не только вид и фаза развития микроорганизмов, но и их количество. Ни один дезинфектант не способен уничтожить все имеющиеся на каком-либо объекте микроорганизмы: 100%-ное уничтожение при дезинфекции невозможно. Адекватным признано уничтожение 99,99% жизнеспособных микроорганизмов. Более низкие уровни в 99,9% и 99% не являются адекватными. Уничтожение микроорганизмов на уровне 99,99% означает только значительное улучшение ситуации и снижение микробной нагрузки на объекте. Не стоит забывать, что в благоприятных условиях одна единственная бактериальная клетка в течение 10 часов может размножиться и воспроизвести до 10 9 себе подобных особей. Поэтому эффективность дезинфекции напрямую зависит от количества микроорганизмов на обрабатываемой дезинфектантом поверхности: чем оно меньше, тем лучше конечный результат. Этот факт еще раз указывает на необходимость предварительной тщательной санитарной обработки объекта перед его дезинфекцией.

Некоторые свойства дезинфицирующих веществ различных групп приведены в табл.4.

Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных.

Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.

Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.

В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.

В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата, созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ № 2335 и B.licheniformis ВКПМ № 2336.

Было установлено, что этот препарат более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).

Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.

В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяй­стве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин + тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.

Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.

Антибиотики, продуцируемые B.subtilis (Таблица 1)

Ризос тонна-фактор, Микосубтилин, Аспергиллюс-фактор, Бацилизин, Бацилипин

Обутин, Ксантелин, Бацилломиксин

Флювомииин, Ризобацидин, Фунгоцин, Токсимицин, Глобицин

Антибиотик 61-26, Антибиотик TL-119

Антибиотик 3, Полимиксин, Колистин, Бацитрацин, Тироцидин, Грамицидин С, Эдеин, Бутирозин

Образование антибиотиков происходит обычно в логарифми­ческой фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.

Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; вли­яние репрессии на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.

Снижение синтеза антибиотика бациллами обуслов­лено не катаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO₃. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.

Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептид­ных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.

Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование на­званных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: амино­кислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость — центрифугат культуральной жидкости.

Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделя­ются на следующие классы:

— основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30 S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;

— циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;

— линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран — грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК — например, тиротрицин;

— аминогликозидные антибиотики — бутирозин.

В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбифор-мин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49-4, 6633, 26а, В-456, 3, бацилломицин.

Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В 1957 г. из культуры выделены два анти­биотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, ко­торые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.

Aspergillus-фактор — антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное дей­ствие на различные виды грибов и дрожжей.

Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans — в дозе 8,1 мкг/мл; R.solani — 0,4; S.bataticola — 3,5; S.fructicola — 5,9; P.digitatum — 6,2; A.niger — 9,9; B.cinerea — 4,8 мкг/мг.

Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действие на M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.

Бацилизин — антибиотик, который так же, как и бацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.

Бацилломиксин — антибиотический комплекс, опи­санный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.

Бацилломицин — антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против па­тогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.

Бациллин — антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г. Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterella sp.). Вве­дение бациллина мышам внутрибрюшинно в дозе до 1000 мг/кг не вызы­вает патологических изменений.

Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов, не активен в от­ношении бактерий. Природа этого антибиотика не изучена.

Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.

Датемицин — антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.

Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.

Истеидин — антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.

Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г. Антибио­тик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том чис­ле, на патогенные для человека и животных.

Ксантелин получен в 1951 г. Подавля­ет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.

Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый куль­турами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высокоактивен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл — S.fructicola, в дозе 3,75 мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл — нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.

Микобациллин выделен и описан в 1958. В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов — возбудителей некоторых болезней растений.

Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosis avium.

Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериаль­ную активность я в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.

Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningi­tis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.

Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганиз­мы.

Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Пред­ставляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.

Ризостониа-фактор получен из культуры В.sub­tilis 6633. Описан в 1949 г. Характеризуется избира­тельной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая использу­ется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans — 160, R.solani — 45, S.bataticola — 64, S.fructicola — 14, P.digitatum — 68, B.cinerea — 6,4 мкг/мл.

Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B 545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естест­венного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.

Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5-22,5 мкг/мл — Pasteureulla sp.; в дозе 140-200 мкг/мл — S.aureus; 165 мкг/мл — S.typhi.

Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е. coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, Pasteurella sp. в дозах 20 — 50 мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.

Субспорин — комплекс антибиотических веществ, обра­зуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую анти­биотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.

Токсимицин получен в 1952 г. в виде концент­рата. Прояв­ляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.

Трипанотоксин, выделенный в 1911 г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.

Фунгистатин (синоним — антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отноше­нии некоторых грибов, патогенных для человека, животных и расте­ний. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.

Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиоти­ческим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсор­бируется на активированном угле. Не инактивируется пепсином или трипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100Д.

Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.

Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в боль­ших дозах — S.haemolyticus и M.tuberculosis.

Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибио­тическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.

Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотик TL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.

В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о поли­пептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика — В.subtilis 26a – был изолирован из кишеч­ника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и неидентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе раз­вития культуры — в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.

Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3 мкг/мл. По спектру антимикробного дейст­вия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.

В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезиру­емый культурой В.subtilis TL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 — 800Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибио­тика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.

Об антибиотике В-456, образуемом В.subti­lis, сообщил в 1956 г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин. Обладает про­тивогрибным действием.

Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurospora crassa; вторая — Penicillium chrysogenum, третья — Trichophyton tonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества — полипеп­тиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.

Антибиотик 61-26 образуется культурой В. subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактон или эфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200Д. Содержит следую­щие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валин и изолейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамполо-жительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патоген­ные для человека и животных.

В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штам­ма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotris alternans Bonord и Dendrodochium toxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps. aeruginosa, В.anthracis, C. albicans. Согласно предварительным данным о хими­ческой природе антибиотика, это — низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.

Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борь­бы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachy­botris alternans и Dendrodochium toxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспен­зии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды.

Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotris alternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба сни­жается в зависимости от продолжительности и контакта микромицета с антагонистом: через две недели — в 6 раз, через месяц — в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.

Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.

Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ

По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов раз­личных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разно­образных субстратах.

Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus (Таблица 2)