Ифа серологический метод

Что такое серологическое исследование крови?

Серологическое исследование (СИ) основано на способности антигенов и антител связываться друг с другом. СИ позволяет с точностью выявить наличие у пациента определённого вируса либо бактерии, группу крови и резус, реактивность организма к антибиотикам, аутоиммунные заболевания, гормональные нарушения, индивидуальную специфичность белков, определить эффективность терапии.

Система иммунитета борется с проникающими в организм болезнетворными микробами (антигенами) при помощи антител, при этом создавая к каждому из вирусов, паразитов либо бактерий свой определённый тип защиты.

Способность иммунитета вырабатывать особые вещества, нейтрализующие вредоносные частицы, была известна учёным давно. Но увидеть реакцию антиген-антитело в лабораторных условиях удалось только в конце XIX века. Было обнаружено, что в результате образования связки, комплексы выпадают в осадок, образуя хлопья либо помутнение. Такие реакции получили названия агглютинации и преципитации. В XX веке серология — наука о свойствах сыворотки, стремительно развивалась, обнаруживались новые методы диагностирования на основе реакций антиген-антитело. На сегодняшний день существует множество способов выявления иммунных комплексов, а СИ являются незаменимым звеном в диагностике, лечении, создании новых медицинских препаратов и вакцин.

Показания к проведению анализа.

Серологические исследования сопровождают современного человека на протяжении всей жизни. Первые анализы на выявление определённых антител проводятся, когда малыш находится ещё в утробе. Беременная женщина сдаёт кровь на различные СИ для определения возможного резус-конфликта либо инфекций, способных навредить вынашиваемому плоду. Когда ребёнок появляется на свет, его ожидают серологические исследования, позволяющие диагностировать врождённые заболевания. Впоследствии анализы сдаются по следующим причинам:

• вирусные, бактериальные, паразитарные инфекции;
• выявление активности, стадии развития болезни;
• гормональные патологии;
• бесплодие;
• аутоиммунные заболевания;
• нарушение обмена веществ;
• аллергии;
• онкологические заболевания;
• планирование беременности, период вынашивания, патологии беременных;
• выявление ревматоидного фактора;
• определение группы крови и резус-фактора;
• эффективность терапии при различных болезнях;
• эффективность вакцинации;
• предоперационный и постоперационный период при необходимости оценки уровня некоторых антител;
• изучение иммунного состояния организма.

Подготовка к исследованию.

Так как серологические исследования охватывают широкий спектр анализов, в каждом конкретном случае может понадобиться определённая подготовка, но существуют общие правила сдачи серологического теста:

• За сутки до исследования следует ограничить в рационе жирное и жареное, исключить алкоголь.
• Последний приём пищи должен завершиться за 10 — 12 часов до анализа.
• В день сдачи крови не следует употреблять кофе, чай либо иные напитки. Можно в небольшом количестве пить чистую воду.
• Лекарственные средства перед анализом исключаются. Если приём отменить невозможно, необходимо предоставить врачу полный перечень препаратов, в том числе витаминов, пероральных контрацептивов.
• Все другие исследования либо медицинские манипуляции проводятся после СИ.
• Курение рекомендуется прекратить за 12 часов до взятия образца крови.
• В предыдущий день следует избегать физических и эмоциональных нагрузок, а перед исследованием желательно 15 минут посидеть в полном покое.
• СИ назначаются на утреннее время и сдаются натощак.

Методы проведения серологического исследования.

Все методики определения комплексов антиген-антитело (Аг-Ат) основываются на использовании известного Аг либо Ат в поиске неизвестного. Если необходимо обнаружить Аг, необходимы диагностические иммунные сыворотки с содержанием специфических Ат. Если целью СИ является выявление Ат, используются диагностикумы — взвеси, содержащие определённые Аг.

Серологические анализы могут отражать качественный либо количественный результат. При качественном исследовании итог может быть отрицательный или положительный, то есть искомый элемент либо обнаружен, либо нет. Количественный итог выражается в виде числового значения либо знаками «+» (обычно от одного до четырёх).

Методы серологических исследований:

• Агглютинация. Связывание Ат с Аг с последующим формированием хлопьев либо осадка. Применяются прямые, непрямые, развёрнутые, ориентировочные реакции, позволяющие выявить антитела в сыворотке.
• Гемагглютинация. Используются эритроциты с адсорбированными на них Аг либо Ат, которые склеиваются с соответствующими Ат и Аг. Образуемые комплексы выпадают в виде фестонного осадка.
• Преципитация. Образование комплекса Аг-Ат с последующим осаждением в виде помутнения, именуемого преципитатом.
• Коагглютинация. Выявление Аг при помощи Ат, адсорбированных на белке клеток стафилококка.
• Торможение гемагглютинации. Ат иммунной сыворотки подавляют вирусные Аг, в итоге вирусы теряют способность склеиваться с эритроцитами.
• Непрямая реакция Кумбса. Определяются Ат к поверхностным Аг эритроцитов.
• Кольцепреципитация. Проводится на основе иммунной сыворотки с наслоением растворимого Аг.
• Двойная радиальная иммунодиффузия. Реакция основана на диффундировании компонентов антисыворотки и Аг в лунках агара либо агарозы.
• Реакция связывания комплемента. Связь Аг и Ат сопровождается адсорбцией комплемента, в качестве индикатора используются эритроциты барана и Ат к ним в составе гемолитической сыворотки.
• Нейтрализация. Основана на нейтрализации вирусного агента антителами.
• Реакции, основанные на маркировании Ат и Аг флуоресцентным либо ферментным составом — иммунофлюорисцентный (РИФ) и иммуноферментный (ИФА) методы.

Иммунофлюорисцентный метод.

Данный метод основан на использовании Ат, меченных флуоресцентным веществом. Чаще всего в качестве метки используется флуоресцеинизотиоционат, обладающий зелёным свечением в лучах ультрафиолета. Результат анализа оценивается по степени яркости свечения. Может быть использован ручной метод определения при помощи люминесцентного микроскопа, оптического микроскопа с люминесцентной насадкой, а также автоматический способ с применением микрочипового цитомера, проточного цитомера либо роботизированного флуоресцентного микроскопа.

РИФ проводится прямым и непрямым методом. Прямой способ означает непосредственное связывание сорбированного Аг с меченым Ат. Непрямой метод подразумевает использование немаркированных Ат для связки с Аг, а затем добавление меченых Ат, что позволяет избежать неспецифических реакций.

Иммуноферментный анализ.

ИФА основан на выявлении комплексов Аг-Ат при помощи маркирования одного из компонентов. В качестве метки используются различные ферменты, которые в результате ферментативной реакции образуют окрашивание. Существуют разнообразные методы ИФА, их можно классифицировать как гомогенные и гетерогенные методы.

Гомогенные означают, что все этапы реакции происходят в растворе.

Гетерогенные методы включают разделение на фазы с использованием твёрдого носителя.

Гомогенно-гетерогенные способы основываются на том, что комплексы Аг-Ат формируются в растворе, а затем для разделения используется твёрдая фаза.

Существует множество вариаций методов ИФА, некоторые из них представлены ниже.

1. Сэндвич-метод. К иммобилизованным Ат добавляется раствор с Аг, после образования комплексов носитель отмывают от лишних компонентов и добавляют маркированные Ат. В результате, Аг оказываются зажатыми иммобилизованными и мечеными Ат, откуда и произошло название метода.
2. Неконкурентный непрямой ИФА. К иммобилизованным Аг присоединяют исследуемую сыворотку с Ат. Когда образуются комплексы, лишние Ат смывают и добавляют маркированные Ат, способные связаться с прикреплёнными к поверхностям лунок иммунными комплексами.
3. Конкурентный прямой ИФА. К иммобилизованным Аг вносят исследуемую сыворотку и конъюгат, содержащий маркированные Ат. Формируются комплексы Аг-Ат нескольких видов: с мечеными Ат и с немаркированными Ат, которые вступают между собой в конкуренцию за связь с Аг.

Какие инфекции помогает выявить серологическое исследование.

Если у пациента присутствует определённая симптоматика либо иные исследования указывают на заболевание, назначается серологический анализ.

Серологические исследования используют для диагностики следующих инфекций:

• вирус гепатита А, В, С, D, Е;
• сифилис;
• ВИЧ;
• герпес;
• цитомегаловирус;
• краснуха;
• корь;
• паротит;
• Эпштейн-Барр;
• хеликобактер;
• хламидии;
• микоплазмы;
• токсоплазмы;
• лямблии;
• гельминты;
• уреаплазмы;
• парвовирус;
• вирус ветряной оспы;
• вирус клещевого энцефалита;
• вирус Денге;
• коклюш;
• боррелии;
• легионеллы.

Преимущества серологического метода исследования в диагностике инфекций.

1. Высокая чувствительность и специфичность.
2. Широкий спектр определяемых инфекций.
3. Ранняя диагностика инфицирования.
4. Возможность мониторинга развития заболевания.
5. Быстрота и удобство в исполнении.
6. Возможность использования минимального объёма исследуемого материала.
7. Безопасность исследования.

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Серологический анализ крови представляет собой способ лабораторного исследования определенных антигенов или антител (специфических белков) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма. Данный метод применяется при диагностике инфекционных заболеваний для выявления наличия антител в крови больного к определенному виду вирусов или бактерий, а также для определения групповой принадлежности крови.

Исследуемый материал

Методика проведения анализа или забора крови

Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Особенности транспортировки крови и хранения сыворотки

Для чего используют серологические исследования?

Серологические методы лабораторной диагностики используются для выявления таких заболеваний как эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз, описторхоз, цистицеркоз, токсоплазмоз, амебиаз, лямблиоз, для определения эффективности проведённого курса лечения и, наконец, для обнаружения повторного заболевания после полного выздоровления пациента.

Основные методы серологической диагностики

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Данная реакция является непрямым вариантом серологического исследования, то есть, производится она в два этапа. На первом этапе производят выявление необходимого антитела в циркулирующем комплексе антиген – антитело с помощью антиглобулина, схожего по своей структуре с белками иммунной сыворотки. Выявление искомого антитела возможно также при изучении заранее приготовленного антигенного препарата под люминесцентным микроскопом, без использования антиглобулинов.

Иммунофлюоресцентная реакция – очень трудоёмкий процесс, требующий от специалиста немало времени и ответственности. Начинается реакция с подготовки растворов, затем сыворотки и их контрольные образцы подвергаются титрованию (процесс, позволяющий определить содержание определённого вещества путём постепенного смешивания исследуемого раствора с контролируемым количеством реагента). Подготовленные ранее разведения и их контрольные образцы аккуратно наносятся на предметные стёкла с антигеном. Потом препараты подвергаются инкубации, затем следует их отмывание и высушивание на воздухе. На стёкла с антигеном тонким слоем наносится антисыворотка, после этого производится вторичная инкубация препаратов и, вся предыдущая цепь действий повторяется, завершаясь высушиванием препарата. В результате препарат на предметном стекле подвергается обработке глицерином и исследуется в люминесцентном микроскопе.

Результаты проведённой реакции оцениваются по четырёх бальной шкале, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов:
+ очень слабое свечение клетки, заметное только на её периферии
++ слабое свечение периферии клетки, но с явно заметным зелёным оттенком
+++/++++ яркое свечение зелёного цвета периферии клетки
Титром реакции считается такое разведение сыворотки, где не менее 50 % клеток антигена проявляют чёткое поверхностное свечение, то есть результат реакции +++ или ++++. Значение тира реакции от 1/80 до 1/100.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок:
– отрицательная реакция, которая характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»
+ слабая интенсивность, для данной реакции характерны небольшие одиночные отложения на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки
++ средняя интенсивность, ей свойственно образование на дне лунки «широкого плотного кольца» из неагглютинированных эритроцитов
+++ интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами
++++ резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.
Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее +++, то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода заключается в своеобразном взаимодействии антитела с антигеном. Одним из обязательных условий реакции является предварительная фиксация одного из её компонентов, то есть антигена или антитела, на твёрдых планшетах. Затем, при помощи ферментной метки обнаруживают возникнувшие комплексы антиген – антитело благодаря изменению оптической плотности первоначальной смеси (субстрата), что проявляется изменением интенсивности её окраски. ИФА свойственны некоторые преимущества перед остальными серологическими методами, например, данная реакция является наиболее чувствительной, в тестах используются универсальные реагенты, остающиеся стабильными не менее 6 месяцев, автоматизированный процесс учёта результатов реакции. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит следующие компоненты: паразитарный антиген, специфические сывороточные антитела, конъюгат, планшета с зафиксированным на ней специфическим паразитарным антигеном, контрольные сыворотки.

Постановка реакции ИФА происходит в несколько этапов: вначале производится приготовление необходимых растворов, затем готовятся исследуемые образцы сывороток, а также контрольные сыворотки, позже следует нанесение приготовленных образцов сыворотки и контрольных сывороток на твёрдофазные носители, планшеты инкубируются, промываются и, только после проведённых процедур в лунки планшет вносится конъюгат. Через некоторое время он удаляется путём промывания лунок. На завершающем этапе в лунки вносится субстратная смесь и выдерживается в тёмном месте при комнатной температуре. Оценка результатов проводится автоматически при помощи специальных измерительных приборов, в некоторых случаях допускается визуальный учёт результатов проведённой реакции.

Достоверность и качество методов серологической диагностики зависят от организации проведённого внутреннего и внешнего лабораторного контроля, состоящих из нескольких независимых процедур, предназначенных для оценки качества результатов проведённого анализа.

Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.

В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля , ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).

РА — определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА — более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА — основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ — реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH — способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА — используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА — используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА — лантанидный иммунофлюоресцентный анализ — используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.

Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 3-5 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.

Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни , что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.

Структура ответа. Методы серологической диагностики, суть. Правила забора крови. Трактовка результатов. Парные сыворотки.

Более новые статьи:

• Патогенетическая терапия инфекционных больных — Виды патогенетической терапии, группы препаратов, примеры заболеваний — 17/08/2012 07:55

Серологическое исследование, или, другими словами — серологический анализ, это исследование биологических материалов в лаборатории. Этот анализ позволяет установить наличие болезнетворных бактерий в исследуемом организме, либо — в продуктах, которые проходят контрольную проверку.

Серологические методы диагностики

Исследование сывороток или других биологических объектов (молока, желчи, слюны, смывов слизистой кишечника, а также — копроматериалов) дает достаточно достоверное представление об ответе организма на внедрение инфекционного агента. Следует отметить, что применение серологических методов исследования имеет не только диагностическое значение, но дает достоверные сведения об уровне защиты организма, состоянии популяционного иммунитета, циркуляции различных типов в обследуемом регионе. Результаты серологических обследований могут также дать информацию для оптимизации антигенного состава профилактических препаратов и использоваться с целью оценки иммунологической эффективности вакцин.

Однако нужно отметить, что необходимость исследования парных сывороток крови, забираемых с интервалами 1,5-2 недели, и наличие экспрессных методов диагностики снижают диагностическую ценность серологических реакций.

Поэтому традиционные серологические тесты — реакции связывания комплемента (РСК) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), находят в настоящее время лишь ограниченное применение. Тем не менее простота этих методов, доступность и дешевизна реагентов делают их еще применимыми в лабораторной практике. Постановка РСК и РТГА осуществляется по общепринятым методикам.

Примером использования РСК для изучения поствакцинального иммунитета является работа К. Мидхана (1989 г.). При обследовании сывороток от 116 детей в возрасте 5 месяцев достоверные сероконверсии, по данным РСК, были отмечены в 44% случаев, а по результатам реакции нейтрализации (PH) и имму-ноферментного анализа (ИФА) — в 83 и 96% соответственно.

Исследование иммунитета

С целью изучения популяционного иммунитета с помощью РСК нами было обследовано 1246 сывороток больных ОКЗ в возрасте от нескольких месяцев до 80 лет и старше. Показано, что среднегеометрические титры комплементсвязывающих антител были наиболее высокими в возрастных группах 2 — 4 и старше 60 лет, что подтверждает полученные нами ранее данные о наибольшем распространении ротавирусной инфекции среди лиц указанных возрастных групп.

Анализ на ротавирус

РТГА используется в изучении ротавирусной инфекции чаще, чем РСК, и, как правило, в сочетании с другими лабораторными тестами. Так, Andrade J. Р. et al. применили РТГА, иммуно-блот, блок ИФА для изучения антител к структурным белкам ротавируса VP2, VP4, VP6 й VP7. По данным авторов, у детей от 2 до 4 лет обнаружили антигемагглютинирующие антитела к ротавирусам в 70-80%.

В зависимости от уровня антител к определенным белкам, по данным РТГА, авторы выделили 4 группы лиц. В I и II группы (60%) вошли дети с высоким уровнем антител к VP4 и VP7 и были классифицированы как «иммунные». В III группу (4%) отнесены лица с низким уровнем антител к VP7 и VP6, так называемые «частично иммунные». Дети IV группы (36%), у которых, по данным РТГА, антитела не были обнаружены, обозначены как «неиммунные» и составили группу риска, т. к. среди них возможно развитие выраженной ротавирусной инфекции. Следует отметить, что в данном наблюдении показатели чувствительности РТГА и блок ИФА были вполне сопоставимы.

РТГА неоднократно использовали для изучения структурного белка VP4. Исследования показали, что его гемагглютинирующая активность специфически ингибируется антисывороткой, тем самым подтверждая, что VP4 является гемагглютинином ротавирусов. Аналогичные данные были опубликованы ранее М. Езекиелем (1995 г.).

Таким образом, представленные работы показывают, что РСК и РТГА все еще применяют при изучении ротавирусной инфекции, однако эти методы носят вспомогательный характер и должны дублироваться другими тестами.

Нейтрализационные тесты

Реакция нейтрализации основана на способности иммунных сывороток человека или животных нейтрализовать репродукцию вируса и тем самым предотвратить связанные с этим феноменом проявления. В зависимости от биологической модели этими проявлениями могут быть: развитие заболевания со специфической клиникой, репродукция и выделение вируса, выработка специфических антител, а также появление цитопатического эффекта или образование пляк при использовании культуры клеток.

Макробиологические модели в настоящее время применяются преимущественно в ветеринарии, обнаружение вирусов у людей в большинстве случаев проводится на культуре клеток, как первичных, так и переливаемых. Методы PH подразделяются на две группы по принципиальной схеме постановки. В одной группе методов неразведенная сыворотка соединяется с серийными разведениями вируса, в другой — разведения сыворотки испытываются с постоянной дозой вируса. Для постановки реакции нейтрализации предпочтителен возбудитель, вызывающий выраженный цитопатический эффект или интенсивно репродуцирующийся в биологической модели.

Однако ротавирусы, к сожалению, обладают слабо выраженным цитопатическим эффектом, что убедительно продемонстрировали исследователи под руководством Б. Вебера (1992 г.). Исследование 121 пробы кала больных ОКЗ детей с использованием классического метода выделения вируса на клетках МА-104 под контролем ЦПД выявило только 4 положительных случая (3,3%), тогда как применение современных методов обнаружения ротавирусов (ИФА, ПЦР, ЭФ в ПААГ) позволило повысить этот показатель до 54,4%. Следовательно, для повышения чувствительности PH требуются дополнительные методические приемы, способствующие визуализации редукции вируса, в качестве которых используются: радиоактивная или иммунофлюоресцентная метка, плякобразо-вание, иммунопероксидазная окраска и т. д. При этом следует отметить, что сам принцип определения уровня вируснейтрализующих антител идентичен классическому методу PH, отличаясь от него только способом разрешения, то есть, визуализацией вируснейтрализующей активности сыворотки. В этом случае активность сыворотки определяют по ее способности подавлять проявления инфекционных свойств вируса.

В настоящее время в большинстве исследований используются два метода измерения количества вируснейтрализующих антител к ротавирусу. Один из них основан на подсчете числа индивидуальных вирусинфицированных клеток (метод пляк), специфически связывающихся с антителами, конъюгированными флюоресцентом. В другом тесте об уровне нейтрализации вируса судят по снижению продукции вирусного антигена им-муноферментным методом. Сравнительное изучение обоих методов показало линейную зависимость между показателями ИФА и числом пляк-формирующих единиц для каждого прото-типного штамма серотипа ротавируса: Wa, DS-1, Р, VA-70. Полученные данные позволяют легко определить разведение сыворотки, обеспечивающее нейтрализацию 60% инфекционного вируса (нейтрализующий титр антител). Оказалось, что титры антител при тестировании материалов обоими методами одинаковы и оба теста не различаются по воспроизводимости результатов. Некоторое преимущество метода с использованием антител, меченных флюоресцеином, по мнению авторов, заключается в большей объективности учета результатов (автоматизированная регистрация) и в меньшей трудоемкости.

Для измерения титров вируснейтрализующих антител используют и модифицированную PH посредством блокирования ИФА с помощью моноклональных антител.

• изучению интенсивности выработки вируснейтрализующих антител (ВНА) при естественной инфекции и вакцинации;
• образованию ВНА к различным структурным белкам ротавирусов;
• оценке роли ВНА сывороток крови и секреторных антител слюны и слизистой кишечника в защите от естественной инфекции (Ward R. et al., 1990, 1992, 1993, 1995, 1997).

В заключение необходимо подчеркнуть, что реакция нейтрализации в различных ее модификациях до настоящего времени широко используется как в экспериментальных, так и клинических исследованиях и, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, служит эталоном для всех других серологических методов.

Преципитационный анализ

Преципитационные тесты основаны на взаимодействии сыворотки с вирусными антигенами при помощи осмотических процессов или под влиянием электрического поля в гелевой среде или другого вида носителя. Одним из таких методов является реакция встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Авторы исследовали сыворотки крови здоровых и больных ротавирусной диареей взрослых и детей, а также препараты специфического иммуноглобулина на наличие антител к человеческому ротавирусу методом ВИЭФ в 7% агарозе с добавлением 4% полиэтиленгликоля. Оказалось, что антитела к RV циркулировали достаточно широко и обнаружены у больных взрослых и детей в 90,2-87,7% соответственно, а также у 78,4% здоровых детей в возрасте до 1 года. Все 32 серии иммуноглобулина содержали антитела к РВ в титрах 1:4- 1:128. По мнению авторов, метод пригоден для изучения популяционного иммунитета.

Радиоиммунопреципитация

Другой преципитационной методикой является радиоиммунопреципитация. Авторы использовали этот метод для изучения иммунного ответа к структурным и неструктурным белкам при первичной ротавирусной инфекции и показали, что иммунный ответ был более выражен к VP4, чем к VP7.

При изучении сывороточного и секреторного иммунологического ответа на применение тетравалентной реассортантной вакцины у новорожденных Для этого была использована радиоиммунологическая техника исследования наряду с ИФА и PH. При этом было показано, что иммунный ответ в сыворотке зависит от дозы вводимого антигена; что же касается выявления антител в слюне, то авторы объясняют их появление с потреблением грудного молока.

Реакция радиоиммунопреципитации используется и в тонких научно-исследовательских работах. Так, Дж. Тоссер использовал этот метод для изучения топологии белка VP6 в структуре генома и высказали предположение, что VP 6 участвует в образовании каналов внутреннего капсида.

Другие исследователи в 1994 году также использовали метод радиоиммунопреципитации для изучения иммунологических сдвигов при ротавирусной инфекции. Авторы показали, что в остром периоде регистрируются, главным образом, IgA к VP2 и VP6, в то время как в период реконвалесценции снижалась интенсивность выработки секреторных антител (IgA) не только к VP2, но и к остальным структурным и неструктурным белкам. Позднее аналогичные данные были получены с применением радиоиммунопреципитационного метода. Авторы показали, что в иммунологическом процессе, помимо VP4 и VP7, участвуют также VP2, VP6 и NSP2.

Таким образом, иммунопреципитация использовалась в диагностических целях для изучения иммунного ответа при естественной ротавирусной инфекции.

В последние годы иммунопреципитацию заменил метод радиоиммунопреципитации, который применяется для оценки поствакцинального и постинфекционного иммунитета при RV инфекции и для тонких научно-исследовательских разработок.

Гибридизационные методы

Для определения антител к ротавирусам широко применяют метод иммуноблота. Примером использования Western-blot в диагностике ротавирусной инфекции служит работа Х. Ушижимы (1989 г.), который, с помощью иммуноблотинга, охарактеризовал специфичность антител к структурным белкам RV у 21 ребенка с ОКЗ, а также уровень копроантител классов IgA и IgG к этим белкам у неинфициро-ванных детей. Авторы высказали предположение, что иммуно-блотинг может позволить установить диагноз заболевания по одной пробе копроантител без исследования парных сывороток крови. Возможность применения Western-blot для определения уровня антител к VP1, VP2, VP4, VP6 и VP7 была продемонстрирована Павловым И. и др. (1991 г.). Авторы исследовали сыворотки крови людей и животных на наличие антител к штаммам ротавирусов SA-11, DS-1, Wan Ito и пришли к выводу, что Western-blot может быть с успехом использован для оценки иммунитета в клинической практике.

Полагают, что иммуноблот может быть использован для подтверждения диагноза ротавирусной инфекции без использования парных сывороток по одной пробе копроантител.

Наряду с РТГА и ИФА, иммуноблот использовали для изучения популяционного иммунитета. Обнаружена группа лиц, неиммунных по отношению к VP2, VP4, VP6 и VP7, которые представляют группу риска, в первую очередь требующую защиты средствами активной и пассивной иммунизации (Andrade J. Р. et al., 1996).

Применение иммуноблота в изучении серологических сдвигов в процессе естественной RV инфекции отмечают и Begue R. et al. (1998). Авторы подтвердили, что в иммунном ответе на инфицирование участвуют наиболее часто антитела к VP2 и VP6, менее часто — к VP7 и VP4.

Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресцентный метод в непрямом варианте с использованием антивидовых сывороток, меченных флюорохромом, применяется для титрования испытуемых сывороток на клетках, зараженных ротавирусами. В основе реакции лежит специфическое взаимодействие меченых антител и гомологичного антигена, при этом комплекс антиген-антитело легко обнаруживают с помощью люминесцентного микроскопа.

Используя этот метод, авторы провели серологическое обследование двух групп южно-американских индейцев и выявили высокий процент серопозитивных лиц в обеих группах: 67,8 и 77,4% по данным ИФА и 45,5 и 56,7% по результатам ИФМ соответственно.

В другом исследовании, посвященном определению уровня антител к RV группы С в пуповинной крови с помощью ИФМ, было показано, что у 30% женщин детородного возраста выявлялись эти антитела, свидетельствующие о перенесенной инфекции.

Иммуноферментный анализ используется в настоящее время наряду с PH в серологической диагностике ротавирусной инфекции чрезвычайно широко. Этот метод, основанный на использовании антител или антигена, меченных ферментом, благодаря простоте выполнения и экономичности наиболее приемлем и перспективен для серологической диагностики ротавирусной инфекции. Метод позволяет проводить массовые сероэпидемические обследования населения, оценивать иммунологическую и эпидемиологическую эффективность вакцин, изучать защитную роль антител различных классов в различных биологических жидкостях человеческого организма, а также осуществлять серологическую диагностику ротавирусной инфекции.

Многочисленные исследования с помощью ИФА были проведены Р. Азередо (1989 г.), которые показали, что число больных ОКЗ установленной ротавирусной этиологии было значительно ниже уровня их инфицированности по результатам серологического обследования. Эти данные обнаружили, что многие клинические случаи ротавирусной инфекции не диагностируются методом обнаружения RV в фекалиях. Дальнейшие исследования по изучению распространенности ротавирусной инфекции подтвердили это предположение. При проведении сероэпидемиологических обследований было обнаружено, что 50- 70% населения обладали высоким уровнем антител, что свидетельствует о широкой циркуляции RV в человеческой популяции.

Еще большие возможности открывает ИФА при определении динамики уровня антител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов. Так, по данным авторы методики в 1989 году утверждают, что в процессе вакцинации достоверный прирост антител к RV в крови отмечался в 83-96%. Антиротавирусные антитела классов IgA и IgG одинаково хорошо выявляли ИФА и PH по редукции пляк — 67,6 и 70,0% соответственно. Сероконверсия антител класса IgM была обнаружена у 53 и 44% детей методами ИФА и РСК соответственно. По результатам анализа интенсивности выработки антител разных классов авторы сделали вывод, что наиболее эффективным, простым и быстрым методом выявления сероконверсий после вакцинации является способ обнаружения IgA антител с помощью ИФА.

Этот вывод нашел свое подтверждение и в работе Р. Бишопа (1996 г.), в которой указано, что по результатам обследования 68 пар мать-дитя с диагностированной RV инфекцией показано, что обнаружение антител класса IgA с помощью ИФА в копроматериалах служит наиболее чувствительным маркером как клинически выраженной, так и бессимптомной инфекции. Аналогичные результаты при обследовании детей с выраженной RV диареей были получены Дж. Коломиной в 1998 году.

Однако для изучения интенсивности сероконверсий необходимо исследование парных сывороток, что значительно удлиняет процесс диагностики. В то же время общеизвестно, что появление антител класса IgM является свидетельством начала инфекционного процесса. По нашим данным, полученным при обследовании больных ротавирусной инфекцией методами ИФА и РСК, оказалось, что, по результатам ИФА, все обследованные лица содержали в крови IgM антитела к RV, в то время как по данным РСК — только в 77% (Р

В последние годы с реализацией возможности определения гено- и серотипоспецифических антител ИФА стал поистине универсальным методом изучения ротавирусной инфекции, который используется:

• при изучении выработки антител классов IgA, М, G к отдельным структурным и неструктурным белкам RV;
• в оценке иммунологической эффективности различных видов вакцин: аттенуированных, холодоадаптированных, ДНК-овых, реассортантных;
• при изучении выработки антител в различных биологических жидкостях организма в условиях естественной инфекции и при иммунизации.

Таким образом, как следует из представленных данных, и иммунологические аспекты ротавирусной инфекции изучают при помощи широкого спектра лабораторных методов. Вследствие этого выбор оптимального метода исследования с учетом его разрешающей возможности, экономических и временных затрат достаточно сложен и зависит от задач, стоящих перед исследователями, а также оснащенности лаборатории. И все же из многообразия методов, на наш взгляд, следует выделить два — реакцию нейтрализации на культуре клеток и иммуноферментный анализ, — обеспечивающих изучение антител к различным классам иммуноглобулинов. Особую перспективность этих методов для использования в широкой практике определяет реализованная возможность экспресс-диагностики ротавирусной инфекции.